基礎(chǔ)檢驗(yàn)學(xué)/胎兒成熟度檢查

跳轉(zhuǎn)到：導(dǎo)航, 搜索

臨床基礎(chǔ)檢驗(yàn)學(xué)

體腔液檢查
- 羊水檢查
  - 羊水的生理和病理
  - 羊水標(biāo)本的采集
  - 胎兒成熟度檢查
  - 先天性遺傳性疾病的產(chǎn)前診斷
  - 胎兒血型的預(yù)測(cè)

先天性疾病包括遺傳性疾病，即親代的病態(tài)基因經(jīng)生殖細(xì)胞配子結(jié)合形成合子時(shí)傳給子代的疾病，和非遺傳因素，如一些在配子形成，染色體聯(lián)會(huì)時(shí)的基因突變，受精卵以育等過程中由于某些外在因素的影響而引起和疾病。這類疾病表現(xiàn)為患兒智力，器官結(jié)構(gòu)和功能和種種缺陷。

產(chǎn)前診斷中可將先天性遺傳性關(guān)病分為三大類：

1．染色體病：由于遺傳或環(huán)境因素引起染色體的數(shù)目及結(jié)構(gòu)上的異常造成的疾病。在臨床上可發(fā)現(xiàn)新生兒的有多種畸形并常伴有智力障礙。這類病紅占出生總數(shù)的0.5%，產(chǎn)前診斷的25-50%。

2．單基因遺傳病：僅有一對(duì)基因發(fā)生突變或異常引起的疾病。絕大多數(shù)表現(xiàn)為酶的缺陷。臨床上稱為先天性代謝病。目前能用生化方法診斷的約有300種，其中50%為常染色體顯性遺傳，40%為常染色體隱性遺傳，10%為性連鎖遺傳全以X伴性遺傳為多見。一般占出生總數(shù)的1.8%，產(chǎn)前診斷的6-10%。

3．多基因遺傳?。簝蓪?duì)以上的多對(duì)基因突變。各對(duì)基因呈共顯性，每對(duì)基因的作用是微小的，但若干對(duì)基因作用積累，或形成一個(gè)明顯的效應(yīng)，在臨床上出現(xiàn)一個(gè)病狀群，主要表現(xiàn)為一些先天畸形，如唇、腭裂和畸形足、脊柱裂、無(wú)腦兒、神經(jīng)管畸形、幽門狹窄、先天性髖關(guān)節(jié)脫位、先天性心臟病等，這類病占出生總數(shù)的2.6%，產(chǎn)前診斷的40-50%。某些多基因異常遺傳病，如I型糖尿病、高血壓病、冠心病、哮喘、精神分裂癥等常是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，它只能從群體調(diào)查和空族系譜的發(fā)病率中了解其分布及復(fù)現(xiàn)率。

一、染色體病核型分析

核型分析主要用于檢查染色體因婁衢虞結(jié)構(gòu)異常而造成的遺傳性疾病。一般是將新鮮的羊水20-30毫升，經(jīng)離心得到羊水中的細(xì)胞，經(jīng)RPMI1640培養(yǎng)液與25%小牛血清中培養(yǎng)8-10天后，以秋水仙素處理，使細(xì)胞均停止在M期，經(jīng)獲得分裂相細(xì)胞，將細(xì)胞經(jīng)低參、固定、制片處理后，進(jìn)行Giemsa染色或用顯帶染色，然后進(jìn)行核型分析。

二、性染色質(zhì)檢查和性別基因診斷

（一）性染色質(zhì)檢查

羊水細(xì)胞性染色質(zhì)的檢查有助于診斷性連鎖性遺傳病(sex linked inheritance disease,)如甲、乙型血友病，原發(fā)性低丙種球蛋白血癥，自毀容貌綜合征，肌營(yíng)養(yǎng)不良，G-6PD缺乏癥。粘多糖沉積病二型，糖原代謝病二型如果父親為X-連鎖隱性基因攜帶者，攜帶者，父親正常，則男胎一半正常，一半工半為患者；女胎一半正常，一半為基因攜帶者，可根據(jù)檢測(cè)結(jié)果決定是否繼續(xù)妊娠。常規(guī)的檢查方法是將羊呂10毫升注入離心管，以1000r/min1離心0min棄上清，管底沉淀物加甲醇冰乙酸液8ml固定30min，按前述條件離心棄上清，再加少許新鮮固定液制備成細(xì)胞懸液，取1-2滴于載玻片上，空氣中干燥待染色。

羊水細(xì)胞制片選用于：①X染色質(zhì)檢查（examination of X chromatin 或Barr rest）：一般采用硫瑾或甲苯胺藍(lán)染色，經(jīng)油鏡觀察。鏡下可見到兩類細(xì)胞核，一類核大，核膜完整，結(jié)構(gòu)清晰，染色質(zhì)均勻，稱可數(shù)細(xì)胞；加一類核小固縮或染色過深，結(jié)構(gòu)分辨不清或核重疊，有破損，為非或細(xì)胞。在可數(shù)細(xì)胞的核膜內(nèi)緣處，見到呈深藍(lán)色的三角形，半圓形或饅頭形的染色質(zhì)塊，其大小約1.2μm×0.7μm 左右，即X染色質(zhì)，記錄X性染色質(zhì)的細(xì)胞當(dāng)選目算出其百分率。X染色質(zhì)≥6%者判為女胎，≤5%者判為男胎。②Y染色質(zhì)的檢查采用阿的平熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察，可崢細(xì)胞核的偏中心部或近核膜處有 0.3μm大小的熒光弧狀圓點(diǎn)，輪廓清晰，較其周圍的核質(zhì)熒光屏光為強(qiáng)，有時(shí)熒光點(diǎn)過大或過小，所發(fā)熒光很強(qiáng)，與其余核質(zhì)所熒光分開，這種熒光小體就是Y染色質(zhì)。當(dāng)熒光點(diǎn)過大或過小，所發(fā)熒光很弱與核質(zhì)熒光無(wú)區(qū)別時(shí)，則不是Y染色質(zhì)。選擇核均勻，核完整清晰的可數(shù)細(xì)胞，計(jì)算出有Y染色質(zhì)細(xì)胞的百分率，Y染色質(zhì)細(xì)胞≥5%診斷為男胎，<4%婦胎。如羊水細(xì)胞中X、Y小體同時(shí)大于等于5-6%應(yīng)考慮是否為性染色體數(shù)量異常，此種病例應(yīng)直一步分析核型。

（二）、性別基因診斷

目前隨著基因的診斷技術(shù)發(fā)展，胎兒性別診斷有了更準(zhǔn)確、更靈敏的方法，使對(duì)于性連鎖疾病診斷的正確性可靠性大為提高。最常用的方法是：

1．Y特異DNA 探針對(duì)人性別診斷，有關(guān)Y染色體DNA的探針有多種，如PHY3.4，PHY2.1等，目前最公認(rèn)的是Y染色體特異的SRY基因，在男性性別決定中起關(guān)鍵作用。將羊水細(xì)胞用細(xì)胞裂解液解后，點(diǎn)于硝酸纖維膜上與³²P標(biāo)記SRY基因探針直接進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，或?qū)⒀蛩?xì)胞DNA經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳分離后進(jìn)行Southern印跡雜交，凡出現(xiàn)雜交斑點(diǎn)或代的為男性，不顯示或顯示極弱者為女性。

2.PCR基因擴(kuò)增法測(cè)定性別以常規(guī)蛋白酶-SDS-酚法提取羊水細(xì)胞DNA0.1-1.0μg或直接羊水細(xì)胞裂解得到DNA為模板，進(jìn)行PCR基因擴(kuò)增測(cè)定胎兒性別，用于產(chǎn)前診斷胎兒性別的Y染色體基因有4種：DYZ₁，DYS₁₄，ZFY和SRY。目前認(rèn)為SRY是睪刃決定因子的最佳候選基因，以兩對(duì)SRY基軒HMGRox保守序列的引物進(jìn)行DNA擴(kuò)增1.5%瓊脂糖電泳，溴化已錠染色，根據(jù)фXHae分子量標(biāo)準(zhǔn)，男性胎兒在分子量為271bp處可見一SRY特異區(qū)帶。

三、生化及免疫學(xué)檢查

羊水是清液的生化及免疫學(xué)檢查主要用于遺傳性代謝的病的檢測(cè)。目前已知的遺傳性代謝病有3000多種，有89種可進(jìn)行產(chǎn)前診斷。這些先天性代謝病產(chǎn)前診斷方法大都比較復(fù)雜。目前臨床實(shí)驗(yàn)室能夠開展一些簡(jiǎn)單方法主要用于粘多糖沉各種積病，開放性神經(jīng)管缺陷和某些酶缺陷的檢查。

（一）粘多糖沉積病的檢查

粘多糖沉積病是由于細(xì)胞溶酶體酸性水解酶先天性缺陷所致。根據(jù)病因目前本病可分為八大類型，我國(guó)已報(bào)告200從余例，主要表現(xiàn)為嚴(yán)重的骨骼畸型、腫脾腫大，智力障礙以及其它畸形。粘多糖沉積病產(chǎn)前診斷以測(cè)定培養(yǎng)羊水細(xì)胞內(nèi)特異的酶活力最為可靠，但實(shí)驗(yàn)要求高，一般實(shí)驗(yàn)室難開展。兩種較簡(jiǎn)單的實(shí)用的方法是甲苯胺藍(lán)定性及糖醛酸法半定量測(cè)定。

1．甲苯胺藍(lán)定性：方法同尿液粘多糖檢查。妊娠早期羊水正常者可呈陽(yáng)性，妊娠中后期為陰性如陽(yáng)性提示胎兒患粘多糖沉積病。

2．糖醛酸半定量測(cè)定：羊水中酸性粘多糖與四硼酸鈉硫酸溶液反應(yīng)生成糖醛酸，以每毫無(wú)肌酐中糖醛酸的量反映酸性糖多糖的多少。隨著妊娠的進(jìn)展，糖醛酸含量逐漸減少，妊娠16-20周的參考值為3.3-7.0mg/mgCr，如高于此值應(yīng)考慮有粘多糖沉積肥病。本法除Morguio綜合征外對(duì)其它類型的粘多糖沉積病均有診斷意義。

（二）神經(jīng)管缺陷的檢查

1．甲胎蛋白測(cè)定神經(jīng)管缺陷在產(chǎn)前診斷中占有很大的比例。而羊水甲胎蛋白的測(cè)定目前診斷神經(jīng)管缺陷的常規(guī)方法。AFP主要在胎兒肝臟及卵黃囊內(nèi)合成，羊中AFP來(lái)自胎兒尿，小部分來(lái)自胎兒胃腸道信羊膜，絨毛膜細(xì)胞。正常妊娠羊水中AFP在妊娠15周時(shí)最高，可達(dá)40mg/L，20-22周逐步下降，23周后穩(wěn)定下降，32周后降至25mg/L并一直維持此水平至足月。開放性神經(jīng)管缺陷的胎兒，如無(wú)腦兒和脊柱裂，胎血內(nèi)的AFP可從暴露的神經(jīng)組織和脈絡(luò)叢滲入羊水，使AFP高于正常10倍以上。羊水中AFP測(cè)定對(duì)胎兒神經(jīng)管缺陷診斷屬非特異性的檢查。胎兒血中AFP含量比羊水高150-200倍，故穿刺傷及胎兒及胎盤，可出現(xiàn)假性升高此點(diǎn)必須注意。AFP測(cè)定需將妊娠中期羊水上清稀釋100倍后，按血清AFP免疫學(xué)方法測(cè)定。

AFP除用羊水檢測(cè)外亦可用母體血篩查，診斷開放糖果經(jīng)管畸形的準(zhǔn)確率達(dá)90%以上，因此具有特殊診斷價(jià)值。此外胎兒其它畸形如先天性腎疾病、食道閉鎖、腦積水、骶尾畸形瘤、染色體異常，糖尿病，先兆子癇等各種原因引起的胎盤功能不足，流產(chǎn)，胎死宮內(nèi)等，羊水AFP也可升高。

2．羊水總膽堿酯酶測(cè)定：常用于確認(rèn)升高的羊水AFP水平。羊水含有的膽堿酸酶依其對(duì)乙酰膽堿的親和力差異，分為真性膽堿酯酶和假性膽堿酯酶兩種。胎兒早期機(jī)體內(nèi)即已合成CHE，于妊娠12周時(shí)可測(cè)得羊不中CHE顯著升高，當(dāng)胎兒神經(jīng)稍不成熟時(shí)，從胎兒的禽脊液和血液滲出到羊水中的CHE比成熟時(shí)為多，故做為羊水TCHE測(cè)定，可用于對(duì)開入性神經(jīng)管缺陷的診斷。測(cè)定方法為用丙酰硫代膽堿或乙酰硫代堿用為底物，5，5-二硫代雙為顯色劑的速率法或終點(diǎn)法。

3．羊水中真性乙酰膽堿酯酶測(cè)定羊水中真性乙酰膽堿脂酯活性能增加與胎兒開入性神經(jīng)管畸形高度相關(guān)，ACHE定性的聚丙烯酰胺凝臁電泳分析是當(dāng)前常用的方法，特別是對(duì)于神經(jīng)管畸形可疑癥的確診。該方法首先經(jīng)PH8.1電泳將PCHE和ACHE分開，再根據(jù)酶學(xué)反應(yīng)原理，與CHE底物乙酰硫低膽堿和反映示劑共同溫育，CHE分解底物產(chǎn)生的硫代堿膽與銅離子反應(yīng)形成復(fù)合物，在酶區(qū)事業(yè)出現(xiàn)白色沉淀線。正常羊水電泳后可見一條慢速的PCHE區(qū)帶，快速的ACHE區(qū)帶極微。開入神經(jīng)管缺陷羊水可見明顯的快泳的ACHE區(qū)帶，而同時(shí)平等加入ACHE特異抑制劑BW284C51的樣品電泳后，可見此ACHE區(qū)帶消失。ACHE定性電泳時(shí)一定要做陽(yáng)性與陰性對(duì)照，以保證結(jié)合判斷準(zhǔn)確無(wú)誤，漲膠電泳分析為無(wú)腦畸形和開入性脊柱裂的篩診陽(yáng)性率可達(dá)到99.5%，但胎兒患臍疝流產(chǎn)和其它嚴(yán)重先天畸形進(jìn)羊水ACHE也可陽(yáng)性。因此對(duì)于診斷結(jié)論，決定是否完成或終止妊娠必須結(jié)合其它檢查綜合考慮。

（三）胰腺纖維囊性變的檢查

1．γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶測(cè)定：正常妊娠羊水GGT活性以妊娠14-15周時(shí)最為高，約為母體血漿的10-100倍，然后漸降，至胎齡30-40周時(shí)，只有15周時(shí)的1/40。于15周左右測(cè)定GGT的產(chǎn)前的早期診斷胰腺纖維囊性變的最佳指標(biāo)，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性達(dá)77-84%，GGT下降的原因是富含GGT的小腸微絨毛停止發(fā)育或有酶的抑制物釋入羊水所至。此外胎兒的染色的體病，如21三體或18三體綜合征畸胎GGT也明顯的下降。

2．堿性磷酯酶測(cè)定羊水ALP在妊娠19周左右活性最高，然后漸降，至29周后活性降至產(chǎn)前水平。在妊娠16-24周羊水ALP中3/4為小腸型，1/4為肝、骨、腎型。胎兒胰腺纖維囊性變時(shí)由于腸粘膜表面微絨毛異常而致小腸型ALP極度下降，此外可協(xié)助診斷此外21三體18三體綜合征畸胎也可見ALP活性降低。

（四）死胎的檢查

1．肌酯激酶測(cè)定羊水CK活性與胎齡無(wú)關(guān)，在正常孕婦羊水中約為其血清濃度的1/5或更低，主工為CK-BB。羊水中CK升高主要來(lái)源于死胎組織的骨骼肌分解，所以CK活性與死亡時(shí)間呈正相關(guān)，而且是CK-MM升高。此外畸胎瘤、腹裂或無(wú)腦畸胎羊水的CK-BB含量亦可升高。

2．乳酸脫氫酶測(cè)定死胎羊水LD活性明顯升高，但由于宮內(nèi)組織損傷，羊水受紅細(xì)胞污染等均可引起羊水LD增高，故特異性不強(qiáng)。

四、羊水細(xì)胞內(nèi)酶分析

采用微時(shí)測(cè)定法測(cè)定羊水細(xì)胞中某種酶的活性，診斷胎兒是否有此種酶的異常。方法是將羊水細(xì)胞放在鋪有聚酯膜的塑料培養(yǎng)皿中培養(yǎng)8-14天，待細(xì)胞生長(zhǎng)到1000-10000個(gè)時(shí)，迅速將長(zhǎng)有細(xì)胞的培養(yǎng)皿冰凍干燥，然后在顯微鏡下將其切成含10-20個(gè)細(xì)胞的小片，在石蠟的保護(hù)下，將其與少量底物保溫，當(dāng)細(xì)胞和底物發(fā)生反應(yīng)后，用毛細(xì)管吸出已形成的熒光顯色產(chǎn)物，在顯微分光光度計(jì)或顯微熒光光度計(jì)下進(jìn)行測(cè)定。酶缺陷純合子者不顯色。雜合子者顯色較正常對(duì)照減低。

五、基因工程用于產(chǎn)前診斷

1．DNA分子雜交法，用已知的一段互補(bǔ)DNA作為探針，經(jīng)放射標(biāo)記后與羊水細(xì)胞的DNA進(jìn)行印跡雜交，并用放射自顯影法得出結(jié)果，來(lái)診斷胎兒的遺傳性疾病，如用珠蛋白α基因片段兩個(gè)探針檢測(cè)α珠蛋白生成障礙性貧血。

2．限制性內(nèi)切酶多態(tài)性位點(diǎn)的連鎖分析DNA限制性內(nèi)切酶能識(shí)別特定的堿基順序，因而能在只別位點(diǎn)特異地把NDA切割成各種一定大小的片段，通過瓊脂糖凝膠電泳的分離，直接用溴化乙錠顯色或用Southern印跡法把這些NDA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，再與已用核素標(biāo)記的特異基因探針進(jìn)行NDA分子雜交，采用放射自顯影技術(shù)，顯示出相應(yīng)的NDA片段，從而可鑒定出是否有基因缺失或異常，例如中國(guó)人β珠蛋白生成障礙性貧血的RELP連鎖分析。

3．利用PCR技術(shù)擴(kuò)增NDA探測(cè)致病基因利用PCR技術(shù)可將一個(gè)基因拷貝放大10萬(wàn)倍，所得大量均一的NDA再用寡核苷酸探針雜交，放射自顯影和酶切位點(diǎn)分析探測(cè)致病基因。至今利用PCR可推測(cè)的遺傳病約有50多種。

以上這些分子生物學(xué)技術(shù)已廣泛用于遺傳性疾病的產(chǎn)前診斷如鐮狀細(xì)胞性貧血，Bart水腫胎兒、HBH病信其它α珠蛋白生成障礙性貧血基因攜帶者、β珠蛋白生成障礙性貧血、甲型血友病、α-抗胰蛋白酶缺乏癥苯丙酮尿癥、杜氏進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、Wilson病、Huntington舞蹈病等，做為先天性遺傳性疾病的診斷技術(shù)必將有廣泛的應(yīng)用前景。