蛋白質(zhì)折疊
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結(jié)構(gòu)決定功能，僅僅知道基因組序列并不能使我們充分了解蛋白質(zhì)的功能，更無法知道它是如何工作的。蛋白質(zhì)可憑借相互作用在細(xì)胞環(huán)境(特定的酸堿度、溫度等)下自己組裝自己，這種自我組裝的過程被稱為蛋白質(zhì)折疊。
蛋白質(zhì)折疊問題被列為“21世紀(jì)的生物物理學(xué)”的重要課題，它是分子生物學(xué)中心法則尚未解決的一個重大生物學(xué)問題。從一級序列預(yù)測蛋白質(zhì)分子的三級結(jié)構(gòu)并進(jìn)一步預(yù)測其功能，是極富挑戰(zhàn)性的工作。研究蛋白質(zhì)折疊，尤其是折疊早期過程，即新生肽段的折疊過程是全面的最終闡明中心法則的一個根本問題，在這一領(lǐng)域中，近年來的新發(fā)現(xiàn)對新生肽段能夠自發(fā)進(jìn)行折疊的傳統(tǒng)概念做了根本的修正。這其中，X射線晶體衍射和各種波譜技術(shù)以及電子顯微鏡技術(shù)等發(fā)揮了極其重要的作用。第十三屆國際生物物理大會上，Nobel獎獲得者Ernst在報告中強(qiáng)調(diào)指出，NMR用于研究蛋白質(zhì)的一個主要優(yōu)點在于它能極為詳細(xì)的研究蛋白質(zhì)分子的動力學(xué)，即動態(tài)的結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)的運動與蛋白質(zhì)分子功能的關(guān)系。目前的NMR技術(shù)已經(jīng)能夠在秒到皮秒的時間域上觀察蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的運動過程，其中包括主鏈和側(cè)鏈的運動，以及在各種不同的溫度和壓力下蛋白質(zhì)的折疊和去折疊過程。蛋白質(zhì)大分子的結(jié)構(gòu)分析也不僅僅只是解出某個具體的結(jié)構(gòu)，而是更加關(guān)注結(jié)構(gòu)的漲落和運動。例如，運輸小分子的酶和蛋白質(zhì)通常存在著兩種構(gòu)象，結(jié)合配體的和未結(jié)合配體的。一種構(gòu)象內(nèi)的結(jié)構(gòu)漲落是構(gòu)象轉(zhuǎn)變所必需的前奏，因此需要把光譜學(xué)，波譜學(xué)和X 射線結(jié)構(gòu)分析結(jié)合起來研究結(jié)構(gòu)漲落的平衡，構(gòu)象改變和改變過程中形成的多種中間態(tài)，又如，為了了解蛋白質(zhì)是如何折疊的，就必須知道折疊時幾個基本過程的時間尺度和機(jī)制，包括二級結(jié)構(gòu)（螺旋和折疊）的形成，卷曲，長程相互作用以及未折疊肽段的全面崩潰。多種技術(shù)用于研究次過程，如快速核磁共振，快速光譜技術(shù)（熒光，遠(yuǎn)紫外和近紫外圓二色）。
【1蛋白質(zhì)折疊研究的概況】
在生物體內(nèi)，生物信息的流動可以分為兩個部分：第一部分是存儲于DNA序列中的遺傳信息通過轉(zhuǎn)錄和翻譯傳入蛋白質(zhì)的一級序列中，這是一維信息之間的傳遞，三聯(lián)子密碼介導(dǎo)了這一傳遞過程；第二部分是肽鏈經(jīng)過疏水塌縮、空間盤曲、側(cè)鏈聚集等折疊過程形成蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，同時獲得生物活性，從而將生命信息表達(dá)出來；而蛋白質(zhì)作為生命信息的表達(dá)載體，它折疊所形成的特定空間結(jié)構(gòu)是其具有生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，也就是說，這個一維信息向三維信息的轉(zhuǎn)化過程是表現(xiàn)生命活力所必需的。
自從20世紀(jì)60年代，Anfinsen基于還原變性的牛胰RNase在不需其他任何物質(zhì)幫助下，僅通過去除變性劑和還原劑就使其恢復(fù)天然結(jié)構(gòu)的實驗結(jié)果，提出了“多肽鏈的氨基酸序列包含了形成其熱力學(xué)上穩(wěn)定的天然構(gòu)象所必需的全部信息”的“自組裝學(xué)說”以來，隨著對蛋白質(zhì)折疊研究的廣泛開展，人們對蛋白質(zhì)折疊理論有了進(jìn)一步的補(bǔ)充和擴(kuò)展。Anfinsen的“自組裝熱力學(xué)假說”得到了許多體外實驗的證明，的確有許多蛋白在體外可進(jìn)行可逆的變性和復(fù)性，尤其是一些小分子量的蛋白，但是并非所有的蛋白都如此。而且由于特殊的環(huán)境因素，體內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊遠(yuǎn)非如此。
體內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊往往需要有其他輔助因子的參與，并伴隨有ATP的水解。因此，Ellis 于1987年提出了蛋白質(zhì)折疊的“輔助性組裝學(xué)說”。這表明蛋白質(zhì)的折疊不僅僅是一個熱力學(xué)的過程，顯然也受到動力學(xué)的控制。有的學(xué)者基于有些相似氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有不同的折疊結(jié)構(gòu)，而另外一些不同氨基酸序列的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上卻相似的現(xiàn)象，提出了mRNA二級結(jié)構(gòu)可能作為一種遺傳密碼從而影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的假說。但目前為止，該假說尚沒有任何實驗證據(jù)，只有一些純數(shù)學(xué)論證［3］。那么，蛋白質(zhì)的氨基酸序列究竟是如何確定其空間構(gòu)象的呢？圍繞這一問題科研人員已進(jìn)行了大量出色的工作，但迄今為止我們對蛋白質(zhì)的折疊機(jī)制的認(rèn)識仍是不完整的，甚至有些方面還存在著錯誤的觀點。
在這方面作出重要貢獻(xiàn)的典型研究實例是美國C.B.安芬森小組關(guān)于牛胰核糖核酸酶的變性和復(fù)性的研究。牛胰核糖核酸酶含有124個氨基酸殘基,由8個巰基配對組成4對二硫鍵?？梢杂嬎愠雒阜肿又?個巰基組成4對二硫鍵的可能方式有105種,這就提供了一個定量估算復(fù)性重組的指標(biāo)。在溫和的堿性條件下,8摩爾的濃脲和大量巰基乙醇能使四對二硫鍵完全還原，整個分子變?yōu)闊o規(guī)則卷曲狀，酶分子變性。透析去除脲，在氧的存在下，二硫鍵重新形成，酶分子完全復(fù)性，二硫鍵中成對的巰基都與天然一樣，復(fù)性分子可以結(jié)晶且具有與天然酶晶體相同的X射線衍射花樣，從而證實，酶分子在復(fù)性過程中,不僅能自發(fā)地重新折疊,而且只選擇了105種二硫鍵可能配對方式中的一種。
【2蛋白質(zhì)折疊機(jī)制的理論模型】
▲框架模型（Framework Model）
框架模型［4］ 假設(shè)蛋白質(zhì)的局部構(gòu)象依賴于局部的氨基酸序列。在多肽鏈折疊過程的起始階段, 先迅速形成不穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)單元； 稱為“flickering cluster”, 隨后這些二級結(jié)構(gòu)靠近接觸, 從而形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)框架；最后，二級結(jié)構(gòu)框架相互拼接，肽鏈逐漸緊縮，形成了蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。這個模型認(rèn)為即使是一個小分子的蛋白也可以一部分一部分的進(jìn)行折疊, 其間形成的亞結(jié)構(gòu)域是折疊中間體的重要結(jié)構(gòu)。
▲疏水塌縮模型（Hydrophobic Collapse Model）
在疏水塌縮模型［5］中，疏水作用力被認(rèn)為是在蛋白質(zhì)折疊過程中起決定性作用的力的因素。在形成任何二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)之前首先發(fā)生很快的非特異性的疏水塌縮。
▲擴(kuò)散-碰撞-粘合機(jī)制 （Diffusion-Collision-Adhesion Model）
該模型認(rèn)為蛋白質(zhì)的折疊起始于伸展肽鏈上的幾個位點，在這些位點上生成不穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)單元或者疏水簇，主要依靠局部序列的進(jìn)程或中程（3-4個殘基）相互作用來維系。它們以非特異性布朗運動的方式擴(kuò)散、碰撞、相互黏附，導(dǎo)致大的結(jié)構(gòu)生成并因此而增加了穩(wěn)定性。進(jìn)一步的碰撞形成具有疏水核心和二級結(jié)構(gòu)的類熔球態(tài)中間體的球狀結(jié)構(gòu)。球形中間體調(diào)整為致密的、無活性的類似天然結(jié)構(gòu)的高度有序熔球態(tài)結(jié)構(gòu)。最后無活性的高度有序熔球態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橥暾挠谢盍Φ奶烊粦B(tài)。
▲成核-凝聚-生長模型（Nuclear-Condensation-Growth Model）
根據(jù)這種模型，肽鏈中的某一區(qū)域可以形成“折疊晶核”，以它們?yōu)楹诵?，整個肽鏈繼續(xù)折疊進(jìn)而獲得天然構(gòu)象。所謂“晶核”實際上是由一些特殊的氨基酸殘基形成的類似于天然態(tài)相互作用的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這些殘基間不是以非特異的疏水作用維系的，而是由特異的相互作用使這些殘基形成了緊密堆積。晶核的形成是折疊起始階段限速步驟。
▲拼版模型（Jig-Saw Puzzle Model）
此模型［9］的中心思想就是多肽鏈可以沿多條不同的途徑進(jìn)行折疊, 在沿每條途徑折疊的過程中都是天然結(jié)構(gòu)越來越多, 最終都能形成天然構(gòu)象, 而且沿每條途徑的折疊速度都較快, 與單一途徑折疊方式相比, 多肽鏈速度較快, 另一方面, 外界生理生化環(huán)境的微小變化或突變等因素可能會給單一折疊途徑造成較大的影響，而對具有多條途徑的折疊方式而言, 這些變化可能給某條折疊途徑帶來影響, 但不會影響另外的折疊途徑, 因而不會從總體上干擾多肽鏈的折疊, 除非這些因素造成的變化太大以致于從根本上影響多肽鏈的折疊。
【分子伴侶】
1978 年,Laskey 在進(jìn)行組蛋白和DNA 在體外生理離子強(qiáng)度實驗時發(fā)現(xiàn),必須要有一種細(xì)胞核內(nèi)的酸性蛋白———核質(zhì)素(nucleoplasmin) 存在時,二者才能組裝成核小體,否則就發(fā)生沉淀。據(jù)此Laskey 稱它為“分子伴侶”。分子伴侶是指能夠結(jié)合和穩(wěn)定另外一種蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定構(gòu)象,并能通過有控制的結(jié)合和釋放,促進(jìn)新生多肽鏈的折疊、多聚體的裝配或降解及細(xì)胞器蛋白的跨膜運輸?shù)囊活惖鞍踪|(zhì) ［10，11］ 。分子伴侶是從功能上定義的,凡具有這種功能的蛋白質(zhì)都是分子伴侶,它們的結(jié)構(gòu)可以完全不同。這一概念目前已延伸到許多蛋白質(zhì),現(xiàn)已鑒定出來的分子伴侶主要屬于三類高度保守的蛋白質(zhì)家族［12］：stress 90 family、stress 70 family、stress 60 family。其中stress 60 family存在于真核生物的線粒體（在哺乳動物中稱為Hsp58）、葉綠體（稱為cpn60）中，在原核生物的細(xì)胞質(zhì)中，它被稱為GroEL。
【意義和前景】
蛋白質(zhì)折疊機(jī)制的闡明將揭示生命體內(nèi)的第二套遺傳密碼，這是它的理論意義。蛋白質(zhì)折疊的研究，比較狹義的定義就是研究蛋白質(zhì)特定三維空間結(jié)構(gòu)形成的規(guī)律、穩(wěn)定性和與其生物活性的關(guān)系。在概念上有熱力學(xué)的問題和動力學(xué)的問題；蛋白質(zhì)在體外折疊和在細(xì)胞內(nèi)折疊的問題；有理論研究和實驗研究的問題。這里最根本的科學(xué)問題就是多肽鏈的一級結(jié)構(gòu)到底如何決定它的空間結(jié)構(gòu)？既然前者決定后者，一級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)之間肯定存在某種確定的關(guān)系，這是否也像核苷酸通過“三聯(lián)密碼”決定氨基酸順序那樣有一套密碼呢？有人把這設(shè)想的一級結(jié)構(gòu)決定空間結(jié)構(gòu)的密碼叫作“第二遺傳密碼”。
如果說“三聯(lián)密碼”已被破譯而實際上已成為明碼，那么破譯“第二遺傳密碼”正是“蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測”從理論上最直接地去解決蛋白質(zhì)的折疊問題，這是蛋白質(zhì)研究最后幾個尚未揭示的奧秘之一?！暗鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測”屬于理論方面的熱力學(xué)問題。就是根據(jù)測得的蛋白質(zhì)的一級序列預(yù)測由Anfinsen原理決定的特定的空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)氨基酸序列，特別是編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的測定現(xiàn)在幾乎已經(jīng)成為常規(guī)技術(shù)，從互補(bǔ)DNA（cDNA）序列可以根據(jù)“三聯(lián)密碼”推定氨基酸序列，這些在上一世紀(jì)獲得重大突破的分子生物學(xué)技術(shù)，大大加速了蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定。目前蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)存有大約17萬個蛋白的一級結(jié)構(gòu)，但是測定了空間結(jié)構(gòu)的蛋白大約只有1．2萬個，這中間有許多是很相似的同源蛋白，而真正不同的蛋白只有1000多個。隨著人類基因組計劃的勝利完成，解讀了人類DNA的全序列，蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)增長必定會出現(xiàn)爆炸的態(tài)勢，而空間結(jié)構(gòu)測定的速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后，因此二者之間還會形成更大的距離，這就更需要進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測。
同時，它還存在重要的潛在應(yīng)用前景，例如以下幾個方面：
▲利用DNA重組技術(shù)可以將外源基因導(dǎo)入宿主細(xì)胞。但重組基因的表達(dá)產(chǎn)物往往形成無活性的、不溶解的包涵體。折疊機(jī)制的闡明對包涵體的復(fù)性會有重要幫助。
▲DNA重組和多肽合成技術(shù)的發(fā)展使我們能夠按照自己的意愿設(shè)計較長的多肽鏈。但由于我們無法了解這一多肽將折疊為何種構(gòu)象，從而無法按照自己意愿設(shè)計我們需要的、具有特定功能的蛋白質(zhì)。
▲許多疾病，如阿茲海默癥(Alzheimer's)，瘋牛病(Mad Cow, BSE)，可傳播性海綿狀腦病(CJD)，肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)，還有帕金森氏癥(Parkinson's)等正是由于一些細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白發(fā)生突變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚沉或錯誤折疊而造成的。因此，深入了解蛋白質(zhì)折疊與錯誤折疊的關(guān)系對于這些疾病的致病機(jī)制的闡明以及治療方法的尋找將大有幫助。
▲基因組序列的發(fā)展使我們得到了大量的蛋白質(zhì)序列，結(jié)構(gòu)信息的獲得對于揭示它們的生物學(xué)功能是十分重要的。依靠現(xiàn)有手段（X-ray晶體衍射、NMR及電鏡）測定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)需要較長的時間，因此結(jié)構(gòu)解析的步伐已落后于發(fā)現(xiàn)新蛋白的步伐。而結(jié)構(gòu)預(yù)測的方法雖然速度較快，但可靠性并不高，只有當(dāng)我們對于維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，驅(qū)動蛋白質(zhì)折疊的理化因素更為了解，這一方法才可能有根本的改進(jìn)。另外，我們對于蛋白質(zhì)相互作用、配體與蛋白質(zhì)的作用等結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究也有賴于蛋白質(zhì)折疊機(jī)制的闡明。
【蛋白質(zhì)折疊與“折疊病” 】
人們對由于基因突變造成蛋白質(zhì)分子中僅僅一個氨基酸殘基的變化就引起疾病的情況已有所了解，即所謂“分子病”，如地中海鐮刀狀紅血球貧血癥就是因為血紅蛋白分子中第六位的谷氨酸突變成了頡氨酸?，F(xiàn)在則發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列沒有改變，只是其結(jié)構(gòu)或者說構(gòu)象有所改變也能引起疾病，那就是所謂“構(gòu)象病”，或稱“折疊病”。
大家都知道的瘋牛病，它是由一種稱為Prion的蛋白質(zhì)的感染引起的，這種蛋白質(zhì)也可以感染人而引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病。在正常機(jī)體中，Prion是正常神經(jīng)活動所需要的蛋白質(zhì)，而致病Prion與正常Prion的一級結(jié)構(gòu)完全相同，只是空間結(jié)構(gòu)不同。這一疾病的研究涉及到許多生物學(xué)的基本問題。一級結(jié)構(gòu)完全相同的蛋白質(zhì)為什么會有不同的空間結(jié)構(gòu)，這與Anfinsen原理是否矛盾？顯然這里有蛋白質(zhì)的能量和穩(wěn)定性問題。
從來認(rèn)為蛋白結(jié)構(gòu)的變化來自于序列的變化，而序列的變化來自于基因的變化，生命信息從核酸傳遞到蛋白。而致病Prion的信息已被諾貝爾獎獲得者普魯辛納證明不是來自基因的變化，致病蛋白Prion導(dǎo)致正常蛋白Prion轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏〉恼郫B狀態(tài)是通過蛋白分子間的作用而感染！這種相互作用的本質(zhì)和機(jī)制是什么？僅僅改變了折疊狀態(tài)的分子又如何導(dǎo)致嚴(yán)重的疾??？這些問題都不能用傳統(tǒng)的概念給予滿意的解釋，因此在科學(xué)界引起激烈的爭論，有關(guān)研究的強(qiáng)度和競爭性也隨之大大增強(qiáng)。
由于蛋白質(zhì)折疊異常而造成分子聚集甚至沉淀或不能正常轉(zhuǎn)運到位所引起的疾病還有老年性癡呆癥、囊性纖維病變、家族性高膽固醇癥、家族性淀粉樣蛋白癥、某些腫瘤、白內(nèi)障等等。由于分子伴侶在蛋白質(zhì)折疊中至關(guān)重要的作用，分子伴侶本身的突變顯然會引起蛋白質(zhì)折疊異常而引起折疊病。隨著蛋白質(zhì)折疊研究的深入，人們會發(fā)現(xiàn)更多疾病的真正病因和更針對性的治療方法，設(shè)計更有效的藥物?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)有些小分子可以穿越細(xì)胞作為配體與突變蛋白結(jié)合，從而使原已失去作戰(zhàn)能力的突變蛋白逃逸“蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)”而“帶傷作戰(zhàn)”。這種小分子被稱為“藥物分子伴侶”，有希望成為治療“折疊病”的新藥。 新生肽的折疊問題或蛋白質(zhì)折疊問題不僅具有重大的科學(xué)意義，除了上面提到的在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用價值外，在生物工程上具有極大的應(yīng)用價值。基因工程和蛋白工程已經(jīng)逐漸發(fā)展成為產(chǎn)值以數(shù)十億美元計的大產(chǎn)業(yè)，進(jìn)入21世紀(jì)后，還將會有更大的發(fā)展。但是當(dāng)前經(jīng)常遇到的困難，是在簡單的微生物細(xì)胞內(nèi)引入異體DNA后所合成的多肽鏈往往不能正確折疊成為有生物活性的蛋白質(zhì)而形成不溶解的包含體或被降解。這一“瓶頸”問題的徹底解決有待于對新生肽鏈折疊更多的認(rèn)識。
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