醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)/聚合酶鏈反應(yīng)

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醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)基礎(chǔ)

基因診斷
- 常用基因診斷技術(shù)
  - Southern印跡法
  - 聚合酶鏈反應(yīng)
  - 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性
  - 等位基因的特異寡核苷酸探針診斷法
  - 單鏈構(gòu)象多態(tài)性診斷法

近年來，基因分析和基因工程技術(shù)有了革命性的突破，這主要?dú)w功于聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）的發(fā)展和應(yīng)用。應(yīng)用PCR技術(shù)可以使特定的基因或DNA片段在短短的2-3小時(shí)內(nèi)體外擴(kuò)增數(shù)十萬至百萬倍。擴(kuò)增的片段可以直接通過電泳觀察，也可用于進(jìn)一步的分析。這樣，少量的單拷貝基因不需通過同位素提高其敏感性來觀察，而通過擴(kuò)增至百萬倍后直接觀察到，而且原先需要一、二周才能作出的診斷可以縮短至數(shù)小時(shí)。PCR反應(yīng)的原理如圖13-7。

PCR原理示意圖黑色線代表引物

圖13-7 PCR原理示意圖黑色線代表引物

由圖可見，首先應(yīng)按照欲檢測的DNA的5’和3’端的堿基順序各合成一段長約17-20余個(gè)堿基的寡核苷酸作為引物（primer），其次是將待檢測的DNA變性后，加入四種單核苷酸（dNTP）、引物和耐熱聚合酶。在較低的溫度，引物將與待擴(kuò)增的DNA鏈復(fù)性結(jié)合，然后的聚合酶的作用下，利用溶液中的核苷酸原料，不斷延伸合成新互補(bǔ)鏈，這樣，一條DNA雙鏈就變成了兩條雙鏈。若繼續(xù)按照變性（92－95℃）→復(fù)性（40－60℃）→引物延伸（65－72℃）的順序循環(huán)20至40個(gè)周期，就可以得到大量的DNA片段。理論上循環(huán)20周期可使DNA擴(kuò)增2n，即100余萬倍。PCR反應(yīng)特異性強(qiáng)，靈敏度高，極微量的DNA即可作為擴(kuò)增的模板得到大量的擴(kuò)增片段。毛發(fā)、血痕，甚至單個(gè)細(xì)胞的DNA即可供PCR擴(kuò)增之用。因此它用于病原體DNA的檢查、腫瘤殘留細(xì)胞的檢出、罪犯或個(gè)體遺傳物質(zhì)的鑒定以及遺傳病的基因診斷等。

目前已可對一系列的遺傳病進(jìn)行PCR診斷。如果疾病是由基因缺失引起的（如α地貧），則在缺失兩端設(shè)計(jì)一對引物進(jìn)行擴(kuò)增，就不會得到擴(kuò)增產(chǎn)物或只能得到縮短了的擴(kuò)增產(chǎn)物。如果疾病是由點(diǎn)突變引起的，而突變的位置和性質(zhì)已知，則在設(shè)計(jì)引物時(shí)使之包括突變部位，由于突變后的堿基不配對，結(jié)果無擴(kuò)增片段；或者在引物設(shè)計(jì)時(shí)于其3’端設(shè)計(jì)一個(gè)錯(cuò)誤的核苷酸，使之與突變了的核苷酸配對，其結(jié)果是正常引物不能擴(kuò)增，而用錯(cuò)誤的引物能擴(kuò)增，從而可對突變的存在作出判斷。

PCR技術(shù)目前有許多新的發(fā)展，用途日益擴(kuò)大。例如，可用RNA為模板經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄再行擴(kuò)增的RT－PCR；改變兩引物濃度，使其相差100倍，結(jié)果得到大量單鏈產(chǎn)物，稱為不對稱PCR，其單鏈產(chǎn)物可用于序列分析；在一個(gè)反應(yīng)中加入多對引物同時(shí)檢測多個(gè)部位的多重PCR等等。