生物膜離子通道
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生物膜離子通道(ion channels of biomembrane)，各種無(wú)機(jī)離子跨膜被動(dòng)運(yùn)輸的通路。生物膜對(duì)無(wú)機(jī)離子的跨膜運(yùn)輸有被動(dòng)運(yùn)輸（順離子濃度梯度）和主動(dòng)運(yùn)輸（逆離子濃度梯度）兩種方式。被動(dòng)運(yùn)輸?shù)耐贩Q離子通道，主動(dòng)運(yùn)輸?shù)?a href="/w/%E7%A6%BB%E5%AD%90%E8%BD%BD%E4%BD%93" title="離子載體">離子載體稱為離子泵。生物膜對(duì)離子的通透性與多種生命活動(dòng)過(guò)程密切相關(guān)。例如，感受器電位的發(fā)生，神經(jīng)興奮與傳導(dǎo)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控功能，心臟搏動(dòng)，平滑肌蠕動(dòng)，骨骼肌收縮，激素分泌，光合作用和氧化磷酸化過(guò)程中跨膜質(zhì)子梯度的形成等。
目錄 |
研究簡(jiǎn)史
在生物電產(chǎn)生機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)了生物膜對(duì)離子通透性的變化。1902年J.伯恩斯坦在他的膜學(xué)說(shuō)中提出神經(jīng)細(xì)胞膜對(duì)鉀離子有選擇通透性。1939年A.L.霍奇金與A.F.赫胥黎用微電極插入槍烏賊巨神經(jīng)纖維中，直接測(cè)量到膜內(nèi)外電位差。1949年A.L.霍奇金和B.卡茨在一系列工作基礎(chǔ)上提出膜電位離子假說(shuō)，認(rèn)為細(xì)胞膜動(dòng)作電位的發(fā)生是膜對(duì)納離子通透性快速而特異性地增加，稱為“鈉學(xué)說(shuō)”。尤其重要的是，1952年A.L.霍奇金和A.F.赫胥黎用電壓鉗技術(shù)在槍烏賊巨神經(jīng)軸突上對(duì)細(xì)胞膜的離子電流和電導(dǎo)進(jìn)行了細(xì)致地定量研究，結(jié)果表明Na+和K+的電流和電導(dǎo)是膜電位和時(shí)間的函數(shù)，并首次提出了離子通道的概念。他們的模型 (H-H模型)認(rèn)為，細(xì)胞膜的K+通道受膜上4個(gè)帶電粒子的控制，當(dāng)4個(gè)粒子在膜電場(chǎng)作用下同時(shí)移到某一位置時(shí)，K+才能穿過(guò)膜。
另一方面，1955年，卡斯特羅和B.卡茨對(duì)神經(jīng)-肌肉接頭突觸傳遞過(guò)程的研究發(fā)現(xiàn)：突觸后膜終板電位的發(fā)生，是由于神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(Ach)作用于終板膜上受體的結(jié)果，從而確認(rèn)了受化學(xué)遞質(zhì)調(diào)控的通道。60年代，用各種生物材料對(duì)不同離子通透性的研究表明，各種離子在膜上各自有專一性的運(yùn)輸機(jī)構(gòu)，曾經(jīng)提出運(yùn)輸機(jī)構(gòu)是載體、洞孔和離子交換等模型。1973年和1974年，C.M.阿姆斯特朗、F.貝薩尼利亞及R.D.凱恩斯、E.羅賈斯兩組分別在神經(jīng)軸突上測(cè)量到與離子通道開放相關(guān)的膜內(nèi)電荷的運(yùn)動(dòng)，稱為門控電流，確認(rèn)了離子通道的開放與膜中帶電成分運(yùn)動(dòng)的依從性。1976年E.內(nèi)爾和B.薩克曼創(chuàng)立了離子單通道電流記錄技術(shù)，并迅速得到推廣應(yīng)用，近年用這種技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一些新型離子通道，為深入研究通道的結(jié)構(gòu)和功能提供了有力的工具。
80年代初，學(xué)者們先后從細(xì)胞膜上分離和純化了一些運(yùn)輸離子的功能性蛋白質(zhì)，并在人工膜上成功地重建了通道功能，從而肯定了離子通道實(shí)體就是膜上一些特殊蛋白質(zhì)分子或其復(fù)合物。近年，科學(xué)家應(yīng)用基因重組技術(shù)研究離子通道的結(jié)構(gòu)，1982和1984年，紐莫及合作者先后測(cè)定了N型Ach受體和 Na+通道蛋白的氨基酸序列。
研究方法
離子通道結(jié)構(gòu)和功能的研究需綜合應(yīng)用各種技術(shù)，包括：電壓和電流鉗位技術(shù)、單通道電流記錄技術(shù)、通道蛋白分離、純化等生化技術(shù)、人工膜離子通道重建技術(shù)、通道藥物學(xué)、基因重組技術(shù)及一些物理和化學(xué)技術(shù)。
電壓鉗位技術(shù)
一般而言，膜對(duì)某種離子通透性的變化是膜電位和時(shí)間的函數(shù)。用玻璃微電極插入細(xì)胞內(nèi)，利用電子學(xué)技術(shù)施加一跨膜電壓并把膜電位固定于某一數(shù)值，可以測(cè)定該膜電位條件下離子電流隨時(shí)間變化的動(dòng)態(tài)過(guò)程。利用藥物或改變細(xì)胞內(nèi)外的溶液成分，使其他離子通道失效，即可測(cè)定被研究的某種離子通道的功能性參量，分析離子電流的穩(wěn)態(tài)和動(dòng)力學(xué)與膜電位、離子濃度等之間的關(guān)系，可推斷該種通道的電導(dǎo)、活化和失活速率、離子選擇性等，并能測(cè)量和分析通道的門控電流的特性。
單通道電流記錄技術(shù)
又稱膜片鉗位技術(shù)，用特制的玻璃微吸管吸附于細(xì)胞表面，使之形成10～100GΩ的密封(giga-seal)，被孤立的小膜片面積為μm2量級(jí)，內(nèi)中僅有少數(shù)離子通道。然后對(duì)該膜片實(shí)行電壓鉗位，可測(cè)量單個(gè)離子通道開放產(chǎn)生的pA（10-12安培）量級(jí)的電流，這種通道開放是一種隨機(jī)過(guò)程。通過(guò)觀測(cè)單個(gè)通道開放和關(guān)閉的電流變化，可直接得到各種離子通道開放的電流幅值分布、開放幾率、開放壽命分布等功能參量，并分析它們與膜電位、離子濃度等之間的關(guān)系。還可把吸管吸附的膜片從細(xì)胞膜上分離出來(lái)，以膜的外側(cè)向外或膜的內(nèi)側(cè)向外等方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。這種技術(shù)對(duì)小細(xì)胞的電壓鉗位、改變膜內(nèi)外溶液成分以及施加藥物都很方便。
通道藥物學(xué)研究
應(yīng)用電壓鉗位或單通道電流記錄技術(shù)，可分別于不同時(shí)間、不同部位（膜內(nèi)側(cè)或外側(cè)）施用各種濃度的藥物，研究它們對(duì)通道各種功能的影響。結(jié)合對(duì)藥物分子結(jié)構(gòu)的了解，不但可以深入了解藥物和毒素對(duì)人和動(dòng)物生理功能作用的機(jī)制，還可以從分子水平得到通道功能亞單位的類型和構(gòu)象等信息。
通道蛋白分離、通道重建和基因重組技術(shù)
利用與通道特異結(jié)合的毒劑標(biāo)記，可把通道蛋白質(zhì)從膜上分離下來(lái)，經(jīng)過(guò)純化，可以測(cè)定各亞單位多肽的分子量。然后，把它們加入人工膜，可重新恢復(fù)通道功能。用于確定蛋白質(zhì)氨基酸序列的基因重組技術(shù)的程序是：從細(xì)胞中分離出含有與該種通道蛋白相關(guān)的mRNA，置入某種細(xì)胞(如大腸桿菌)，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。用限制性內(nèi)切酶將cDNA切割成特定片段，再用核酸雜交方法釣出特定的DNA并克隆化。通過(guò)測(cè)定陽(yáng)性克隆DNA的核苷酸順序，推斷出相應(yīng)的蛋白質(zhì)氨基酸序列。
類型和功能特征
離子通道依據(jù)其活化的方式不同，可分兩類：一類是電壓活化的通道，即通道的開放受膜電位的控制，如Na+、Ca+、Cl-和一些類型的K+通道；另一類是化學(xué)物活化的通道，即靠化學(xué)物與膜上受體相互作用而活化的通道，如 Ach受體通道、氨基酸受體通道、Ca+活化的K+通道等。
鈉通道
各種生物材料中，與電興奮相關(guān)的Na+通道有相似的基本特征。通道活化時(shí)間常數(shù)小于1毫秒，失活時(shí)間常數(shù)為數(shù)毫秒，Na+電流的反轉(zhuǎn)電位約+55毫伏。單通道電流記錄顯示，Na+單通道電導(dǎo)為4～20pS，平均開放壽命數(shù)毫秒。Na+通道對(duì)一價(jià)堿金屬離子的選擇通透性比率是：
根據(jù)一些藥物和毒素對(duì)Na+通道功能的不同影響，可分為4種類型：①通道阻斷劑，如河豚毒素(TTX)、石房蛤毒素(STX)。②通道活化增強(qiáng)劑，如β-蝎毒、箭毒蛙毒素(BTX)、藜蘆堿毒素(VER)等。③通道活化抑制劑，如一些局部麻醉劑及其衍生物。④通道失活抑制劑，如鏈霉蛋白酶、N-溴乙酰胺(NBA)等。
鉀通道
根據(jù)功能特性的不同，K+通道可分為以下類型：①慢（延遲）K+通道(K通道)，也就是H-H模型中的K+通道。單通道電流記錄顯示，單個(gè)K通道電導(dǎo)在2～20pS，通道平均開放壽命為數(shù)十毫秒。該種通道可被四乙胺(TEA)等特異性阻斷，通道對(duì)K+有高度選擇性，但R姾和NH嬃亦能通過(guò)，這種通道在神經(jīng)軸突和骨骼肌細(xì)胞膜中有較高密度。②快（早期）K+通道（A通道），該種通道外向的K+流在膜去極化的早期就出現(xiàn)，表明通道的活化時(shí)間常數(shù)比慢K+通道小得多，但在-40毫伏以上該通道即關(guān)閉。電壓鉗位實(shí)驗(yàn)表明，其宏觀電流動(dòng)力學(xué)與Na+電流相似。較低濃度的4-氨基吡啶即能阻斷該通道，它也可被四乙胺阻斷。③Ca2+活化的K+通道〔K(Ca)通道〕，該種通道的開放，不但與膜電位有關(guān)，而且依賴于細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度，每個(gè)通道需結(jié)合兩個(gè)Ca2+才能活化。單通道電導(dǎo)可高達(dá)300pS，并有較長(zhǎng)的開放壽命，這種通道與Ca2+通道協(xié)同作用，對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜電興奮性的節(jié)律有重要意義。它可被四乙胺、N'-四乙酸(EGTA)、奎尼丁和Ba2+阻斷。④內(nèi)向整流的K+通道，其特征是：在膜超極化時(shí)通道開放與膜電位和胞外K+濃度密切相關(guān)，通道開放時(shí)產(chǎn)生內(nèi)向K+電流，單通道電導(dǎo)在5～10pS范圍。
鈣通道
Ca2+通道廣泛存在于各種生物組織的細(xì)胞膜中。宏觀的Ca2+電流動(dòng)力學(xué)特征與Na2+電流相似，但峰值小且失活過(guò)程慢，可達(dá)數(shù)十到數(shù)百毫秒。Ca2+通道對(duì)Ca2+、Ba2+、Sr2+都有高通透性，但Ni2+、Cd2+、Co2+、Mn2+等離子能有效地阻斷Ca2+通道。藥物對(duì)Ca2+通道的作用可分為：①通道阻斷或抑制劑，可分為苯烷基胺類（如異博定、甲基異博定D600）、苯硫氮類、雙氫吡啶類等類型。②通道激活劑，一些雙氫吡啶化合物如BayK8644等藥物可活化Ca2+通道。近年，對(duì)小雞背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)有3種類型的Ca2+通道:①L型，該種通道在膜電位大于-20毫伏時(shí)活化，電流失活緩慢。單通道電導(dǎo)約25pS。②T型，膜電位約-60毫伏時(shí)通道即活化，-10毫伏以上通道電流幅值反而下降，單通道電導(dǎo)約8pS。③N型，該種通道在膜電位不小于-10毫伏才能活化，但又必須超極化到-80毫伏以下才能克服通道的失活。電流動(dòng)力學(xué)比 L型快但比T型慢，單通道電導(dǎo)約13pS。以上3類Ca2+通道在不同細(xì)胞膜上選擇性分布及密度的差別，將影響各種細(xì)胞的生理功能。Ca2+通道除了對(duì)細(xì)胞電興奮性有貢獻(xiàn)外，它通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，可進(jìn)一步調(diào)節(jié)許多細(xì)胞功能。
N型乙酰膽堿受體通道
它是由神經(jīng)遞質(zhì)Ach活化的正離子通道。當(dāng)突觸前膜一次量子化釋放數(shù)千個(gè) Ach分子，它們作用于突觸后膜上的N型受體時(shí)，受體通道開放，產(chǎn)生Na+和K+電流，引發(fā)突觸后膜一個(gè)小終板電位(mEPP)。N-AchR單通道電導(dǎo)在20～60pS范圍，平均開放壽命數(shù)毫秒，通道電流反轉(zhuǎn)電位約-10毫伏，近年發(fā)現(xiàn)該種通道有多種電導(dǎo)態(tài)（見圖）。通道的離子選擇性較差，可允許數(shù)十種無(wú)機(jī)和有機(jī)正離子通過(guò)，許多毒素和有機(jī)物能阻斷或抑制該種通道，α-銀環(huán)蛇毒(α-BGTX)是 N型Ach受體通道的特異性阻斷劑。
80年代以來(lái)，已發(fā)現(xiàn)多種由神經(jīng)遞質(zhì)和激素活化的受體通道，如谷氨酸受體通道、多巴胺受體通道、5-羥色胺受體通道、γ-氨基丁酸受體通道等。
分子構(gòu)象和門控動(dòng)力學(xué)
離子通道研究的前沿是試圖從分子水平揭示通道蛋白的空間構(gòu)象、構(gòu)象變化與通道門控動(dòng)力學(xué)之間的關(guān)系。
N-AchR通道
已測(cè)定了受體蛋白質(zhì)分子量是250000，并測(cè)定了它的全部氨基酸序列，確證該受體通道由、α、γ和δ5個(gè)亞基組成，這4種亞基有相似的氨基酸順序，但只有α亞基上有 α-BGTX的特異結(jié)合位點(diǎn)。一種構(gòu)象模型是：5個(gè)亞基各有若干個(gè)α螺旋跨膜排列，共同形成五瓣?duì)畹?a href="/w/%E8%9B%8B%E7%99%BD%E8%B4%A8%E5%A4%8D%E5%90%88%E7%89%A9" title="蛋白質(zhì)復(fù)合物">蛋白質(zhì)復(fù)合物，兩個(gè)α亞基間是親水的離子通道，通道開口約25埃，中間是6～7埃的狹窄孔道，其中排列有負(fù)電性氨基酸殘基側(cè)鏈。
鈉通道
從電鰻電板分離的鈉通道蛋白質(zhì)分子量是208321，是由1820個(gè)氨基酸組成的多肽序列，可分為4個(gè)相似的區(qū)段，每個(gè)區(qū)段中分別有較集中的正電性和負(fù)電性的氨基酸序列節(jié)段。多種鈉通道構(gòu)象模型的共同特征是:由多個(gè)α螺旋跨膜排列組成通道，通道內(nèi)側(cè)應(yīng)富含極性的氨基酸殘基側(cè)鏈，每個(gè)通道的控制部分由離子選擇性濾器、活化閘門和失活閘門3部分組成，其實(shí)體是氨基酸側(cè)鏈的極性基團(tuán)。膜電位變化時(shí)，電場(chǎng)誘導(dǎo)極性基團(tuán)運(yùn)動(dòng)，使通道局部構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致通道的開放、失活或關(guān)閉，并產(chǎn)生門控電流。
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