臨床生物化學(xué)/載脂蛋白的基因結(jié)構(gòu)及表型
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各種生物都能通過生殖產(chǎn)生子代，子代和親代之間，不論在形態(tài)構(gòu)造或生理功能的特點上都很相似，這種現(xiàn)象稱為遺傳（heredity）。但是，親代和子代之間，子代的各個體之間不會完全相同，總會有所差異，這種現(xiàn)象叫變異（variation）。遺傳和變異是生命的特征。遺傳和變異的現(xiàn)象是多樣而復(fù)雜的，正因為如此，才導(dǎo)致生物界的多種多樣性，生物體所具有的遺傳性狀稱為表型或表現(xiàn)型（phernotype）。生物體所具有的特異基因成分稱為基因型（genotype）。表型是基因型與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。遺傳物質(zhì)是相對穩(wěn)定的，但是又是可變的，遺傳物質(zhì)的變化以及由其所引起表型的改變，稱為突變（mutation）。遺傳物質(zhì)突變包括染色體畸變和基因突變?；蛲蛔兪?a href="/w/%E6%9F%93%E8%89%B2%E4%BD%93" title="染色體">染色體中某一點上發(fā)生化學(xué)改變，所以又稱為點突變（pointmutation）。基因結(jié)構(gòu)和遺傳表型的研究是深入了解脂蛋白代謝缺陷癥的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，逆向遺傳學(xué)方法（reversegeneticapproach）則使其有可能在蛋白質(zhì)水平系統(tǒng)地分析結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系?，F(xiàn)已采用一個特定的cDNA探針從基因文庫中篩選所需要的基因進行cDNA克隆，測定其核苷酸序列，然后從核苷酸序列推斷蛋白質(zhì)氨基酸序列。目前，已分離出許多與動脈粥樣硬化有關(guān)的脂蛋白的cDNA克隆，并將其蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的氨基酸排列順序和基因的核苷酸順序測出?，F(xiàn)已查明，ApoAⅠ、AⅣ、E、B、CⅡ和(a)都存在著異構(gòu)體，也就是說存在著各種不同的表型或基因型，并可分別從蛋白質(zhì)水平和核酸水平進行分型?，F(xiàn)分別介紹幾種主要載脂蛋白的基因結(jié)構(gòu)。
（二）載脂蛋白基因結(jié)構(gòu)特點
人血漿中載脂蛋白的結(jié)構(gòu)及功能，經(jīng)過近十年的深入研究，已了解得較為清楚。大部分載脂蛋白的基因和cDNA都已得到分離和確定，其核苷酸順序也進行了測定。除ApoAⅣ，B、(a)外，它們的共同特點是含有三個內(nèi)含子（intron）和四個外顯子（exon），其內(nèi)含子插入外顯子的位置大致相同，基本上按照生理功能的不同，將其加以分隔。第一個內(nèi)含子把5′-末端的非翻譯區(qū)和翻譯區(qū)分開；第二個內(nèi)含子把信號肽編碼（singnalpeptide）和功能蛋白編碼區(qū)分開；第三個內(nèi)含子則把原肽編碼區(qū)和成熟肽編碼區(qū)分開。這些基因的第一、二、三外顯子的核苷酸數(shù)量也相差無幾，第四個外顯子核苷酸數(shù)量不同而導(dǎo)致各種載脂蛋白基因長度不同。從生物進化角度考慮，上述載脂蛋白基因結(jié)構(gòu)相似性，提示可能來源于一個共同的祖先，即ApoCⅠ基因。ApoAⅣ與其他載脂蛋白基因結(jié)構(gòu)不同，它只含有三個外顯子。載脂蛋白基因結(jié)構(gòu)的另一特點是幾個基因相接很近，定位于同一染色體的一個位點上或附近，呈緊密連鎖狀態(tài)。如ApoAⅠ、CⅢ和AⅣ基因位于第11號染色體長臂2區(qū)，形成一個約15kb的基因簇。還有一個緊密連鎖的基因簇是ApoE、CⅠ和CⅡ基因，同位于第19號染色體長臂3區(qū)，見圖4-4。
ApoA-Ⅱ基因定位于第1號染色體長臂2區(qū)，ApoB基因定位于第2號染色體短臂2區(qū)，Apo(a)基因定位于第6號染色體長臂2區(qū)。
（三）載脂蛋白基因結(jié)構(gòu)
1.ApoAⅠApoAⅠ基因長1863bp，含有三個內(nèi)含子，第一個內(nèi)含子位于5′端非翻譯區(qū)；第二個內(nèi)含子位于翻譯區(qū)的AⅠ前肽區(qū)內(nèi)；第三個內(nèi)含子插入翻譯成熟AⅠ第43氨基酸殘基處。ApoAⅠ基因含有四個外顯子，分布于ApoAⅠ基因的不同區(qū)域，ApoAⅠ基因與ApoCⅢ、AⅣ基因相連成簇，CⅢ基因居中，轉(zhuǎn)錄方向與AⅠ和AⅣ基因相反。位于AⅠ和CⅢ基因共同3′區(qū)的DNA序列，可能參與對AⅠ基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
圖4-4 人載脂蛋白AⅠ、AⅡ、AⅣ、B100、
CⅡ、CⅢ和E基因結(jié)構(gòu)示意圖
粗線代表外顯子，粗線之間的細線代表內(nèi)含子，粗線上緣數(shù)字
代表該段核苷酸數(shù)目
2.ApoBApoB族位于2號染色體P23→Pter區(qū)，是由非翻譯區(qū)、編碼區(qū)、TAA終止密碼子和一個3′端的非翻譯區(qū)組成。ApoB100基因全長43kb，含29個外顯子和28個內(nèi)含子見圖4-4，其中第26和第29兩個外顯子特別長，分別含有7552和1905bp，外顯子2最短，僅39bp（從211-249）。內(nèi)含子則以第27個為最短（107bp）。人群中至少有14種不同的3′端高變異等位基因區(qū)，75％的人群在此區(qū)是不均一的。
ApoB48和ApoB100除了在結(jié)構(gòu)上有關(guān)外，ApoB48的形成機制目前尚無完全一致的看法，主要認(rèn)為有合成ApoB48的基因存在。1987年被發(fā)現(xiàn)ApoB48是由ApoB100通過一種新的機制涉及到mRNA的編輯而產(chǎn)生的。在測定從人小腸基因庫分離的ApoBcDNA的序列時發(fā)現(xiàn)，小腸ApoBcDNA的第6666個核苷酸為T，而從肝分離的ApoBcDNA克隆在此位置為C。將T替換C則6666處產(chǎn)生一終止編碼（TAA），TAA替換CAA編碼使ApoB100的2153位氨基酸應(yīng)為Gln，預(yù)示血漿中存在的ApoB48應(yīng)是相當(dāng)于ApoB100的2153氨基末端為Gln。這一預(yù)測后來得到實驗證實，并發(fā)現(xiàn)核苷酸上6666的替換C→T只發(fā)生在小腸的mRNA上，而不發(fā)生在小腸基因組（genomic）DNA上，因此這是轉(zhuǎn)錄以后的一種特殊形成的編輯小腸mRNA的結(jié)果．
3.ApoE人ApoE基因位于19號染色體長臂3區(qū)，含有四個外顯子和三個內(nèi)含子。
1975年首先觀察到ApoE的多態(tài)性，利用等電聚焦電泳和SDS-PAGE可以確認(rèn)ApoE的多態(tài)性。實驗表明，ApoE有三種異構(gòu)體（isoform）即E2、E3和E4。有的人只含有一種主要異構(gòu)體即純合子，有的人可含二種主要異構(gòu)體為雜合子。由此可見，人群中可有六種不同的表現(xiàn)。根據(jù)ApoE表型提出ApoE基因模型認(rèn)為，ApoE的合成是由位于一個基因位點上的三個等位基因所控制，即E2、E3和E4，每一個等位基因?qū)?yīng)于一個主要異構(gòu)體，產(chǎn)生三種純合子（E2/2，E3/3，E4/4）和三種雜合子（E2/3，E2/4，E3/4）共六種常見表型，另外，還有極少見的異構(gòu)體。一般認(rèn)為，次要異構(gòu)體是由主要異構(gòu)體翻譯后，經(jīng)唾液酸糖化修飾后轉(zhuǎn)變而來。ApoE3/3型又稱野生型。ApoE的基因序列的112位和158位兩種氨基酸殘基即精氨酸（Arg）和半胱氨酸（Cys）的交換決定了異構(gòu)體的種類。ApoE4在這兩個位置上都是Arg；E2都是Cys；112和158位是Arg者為ApoE3異構(gòu)體。自然人群中，基因頻率（3）分布最高，ApoE3/3表型分布約70％，見圖4-5。
4.ApoC族ApoCⅡ基因有3347bp，含有4個外顯子和3個內(nèi)含子。ApoCⅡ的羧基末端氨基酸序列是激活脂蛋白脂肪酶的活性功能區(qū)域。ApoCⅢ基因含有3133bp，有4個外顯子和3個內(nèi)含子。
圖4-5 人ApoE三種主要異構(gòu)體的氨基酸殘基及基因密碼的改變位置
5.Apo(a)運用cDNA探針進行染色體定位研究時發(fā)現(xiàn)，Apo(a)的基因位點在人第6號染色體長臂2區(qū)6-7帶間，與血纖溶酶原（PLG）的基因位點有部分重疊。測定PLG基因跨距為525kb，由18個內(nèi)含子與19個外顯子組成，5個Kringle結(jié)構(gòu)由各自兩個外顯子編碼。Apo(a)cDNA分析表明，Apo(a)與PLG的基因有很多相似之處。
通過家系研究，目前已發(fā)現(xiàn)Apo(a)基因位點中至少有26個等位基因與多態(tài)性有關(guān)。這些等位基因至少表達有34種Apo(a)異構(gòu)體。
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