漢坦病毒
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漢坦病毒歸屬布尼亞病毒科，是一種有包膜分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒，基因組包括L、M、S 3個(gè)片段，分別編碼L聚合酶蛋白、G1和G2糖蛋白、核蛋白。漢坦病毒包括引起腎綜合征出血熱(HFRS)的漢灘病毒(Hantaan virus,HTNV)、漢城病毒(Seoul virus,SEOV)、普馬拉病毒(Puumala virus,PUUV)、多不拉伐病毒(Dobrava virus,DOBV)，引起漢坦病毒肺綜合征(HPS)的無名病毒(Sin Nombre virus,SNV)、紐約病毒(New York virus,NYV)、污黑小河溝病毒(Black Creek Canal virus,BCCNV)、牛軛湖病毒(Bayou virus,BAYV)、安第斯病毒(Andes virus,ANV)以及與人類疾病關(guān)系尚不清楚的一組病毒，如希望山病毒(Prospect Hill virus,PHV)、泰國病毒(Thailand virus,THAIV)、圖拉病毒(Tula virus,TULV)、索托帕拉雅病毒(Thottapalayam virus,TPMV)、哈巴羅夫斯基病毒(Khabarovsk virus,KBRV)、El Moro Canyon病毒(ELMCV)、Rio Segundo病毒(RIOSV)、島景病毒(Isla vista virus,ISLAV)、Muleshoe病毒(MULEV)、Bloodland lake病毒(BLLLV)、Rio Mamore病毒(RMV)、Topografov病毒(TOPV)等。近年來隨著新技術(shù)的應(yīng)用和新型病毒的發(fā)現(xiàn)，漢坦病毒及其相關(guān)疾病的研究得以飛速發(fā)展。1998年3月～7日，第四屆國際HFRS和漢坦病毒會議在美國亞特蘭大市召開，與會的世界各國學(xué)者和專家交流了這一領(lǐng)域的最新研究方法和研究成果。現(xiàn)將會議資料綜述如下：
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1 實(shí)驗(yàn)診斷
漢坦病毒實(shí)驗(yàn)診斷方面的研究，主要集中于重組抗原的應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)診斷方法的快速、敏感和特異。F.Elgh等采用PUU病毒重組核蛋白作為抗原，與乳膠連接進(jìn)行乳膠微粒凝集試驗(yàn)，用于漢坦病毒病的快速血清學(xué)診斷，與采用PUU病毒重組核蛋白作為抗原的ELISA相比，特異性為90%，敏感性為94%。Jiro Arikawa等將桿狀病毒表達(dá)的HTN、SEO、PUU病毒核蛋白用于ELISA，至少應(yīng)用2種重組抗原(HTN和PUU或SEO和PUU)，可以用于漢坦病毒感染的血清學(xué)監(jiān)測。桿狀病毒表達(dá)N端缺失的HTN或SEO病毒核蛋白作為免疫熒光試驗(yàn)(IFA)的抗原，可以區(qū)分HTN與SEO病毒感染。重組核蛋白和N端缺失的核蛋白用于ELISA和IFA，提供了針對漢坦病毒感染的快速、敏感、安全的診斷方法。H.Kallio-Kokko等將桿狀病毒表達(dá)的PUU病毒核蛋白用于IgG和IgM檢測，將大腸桿菌表達(dá)的PUU病毒核蛋白用于IgM檢測，敏感性達(dá)100%，部分表達(dá)的核蛋白用于IgG檢測，敏感性較低(70%)。他們還報(bào)道了在PUU病毒感染的急性病例中，2/3的病例可以采用RT-PCR試驗(yàn)，從病人的血或尿中檢出病毒RNA。T.Tomiyama等將高密度正性顆粒包被純化的漢坦病毒抗原，采用高密度顆粒凝集試驗(yàn)(HDPA)對病毒感染進(jìn)行快速血清學(xué)診斷，對HTN病毒感染的檢測有較高的敏感性和特異性，對PUU、SN病毒的感染也有低水平的交叉反應(yīng)。HDPA與IFA比較，敏感性相近，但比IFA 更為簡便快速。W.Irwin等報(bào)告了現(xiàn)場調(diào)查中免疫印跡試驗(yàn)在鼠類病毒抗體檢測中的應(yīng)用。邱建明等采用5’端生物素標(biāo)記漢灘病毒特異性寡核苷酸探針，結(jié)合磁性分離技術(shù)及改進(jìn)的異硫氰酸胍-酚一步法兩種方法提取病毒RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄套式PCR，用于檢測臨床HFRS病人血清。在7d以內(nèi)病人血清的陽性檢出率為100%，8～14d病人血清的陽性檢出率為57.14%，15d后病人血清仍能檢測到22.73%陽性。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)打點(diǎn)雜交檢測證實(shí)為特異性擴(kuò)增，這為早期確診HFRS病人提供了特異、敏感、快速、直接的診斷方法?！ ?/p>
2 病毒與宿主動物的基因分析
各國學(xué)者采用病毒與宿主的基因分析方法，研究漢坦病毒分離株之間或宿主動物之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，以及病毒與宿主動物的共演化。
2.1 漢坦病毒基因分析 J.W.Song等從韓國絨鼠(Eothenomys regulus)分離了兩株P(guān)UU相關(guān)病毒，命名為Muju(MUJ)病毒。兩株病毒G2基因241bp片段序列存在1.2%差異，G2基因241bp片段和S基因208bp片段與PUU病毒相應(yīng)片段序列的同源性分別為79.5%～83.4%和80.3%～81.2%。L.Yashina等從俄羅斯遠(yuǎn)東鼠(Clethrionomys)、姬鼠(Apodemus)和HFRS病人分離的HTN病毒，M片段序列同源性86%～89%，從輕型HFRS病人分離的SEO病毒，M片段序列同源性97%。M.Drebot首次報(bào)告了加拿大草原田鼠攜帶PH樣病毒。加拿大不同省份SN病毒M、S片段序列存在25%的差異，并且加拿大西部SN病毒株與加拿大東部SN病毒株相比，毒株間基因序列更為接近。Yong-Kyu Chu等報(bào)告來源于印尼板齒鼠的病毒株可被SEO型特異引物擴(kuò)增，M片段290bp序列分析表明與SEO病毒有7%的差異；來源于泰國板齒鼠的病毒株中，2株為SEO病毒，另1株可被HTN型特異引物擴(kuò)增，M片段290bp序列分析表明與THAI 749毒株有1%的差異。J.W.Song等將來自波蘭的TUL病毒與俄羅斯中部和捷克斯洛伐克共和國的TUL病毒比較，核蛋白與G2糖蛋白氨基酸序列同源性大于96%，系統(tǒng)發(fā)生分析表明波蘭的TUL病毒與俄羅斯中部TUL病毒最為接近，但也存在差異。C.Sibold等的另一項(xiàng)研究——對核蛋白編碼基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析表明，西斯洛伐克TUL病毒與捷克TUL病毒相近，東斯洛伐克TUL病毒與俄羅斯中部TUL病毒相近；而3’-NCR的系統(tǒng)發(fā)生分析表明，東斯洛伐克TUL病毒與西斯洛伐克和捷克的TUL病毒相近。作者認(rèn)為，存在東斯洛伐克TUL病毒從中歐和俄羅斯TUL病毒重組的可能性?！ ?/p>
2.2 宿主動物基因分析
多采用細(xì)胞色素B基因分析方法。W.C.Black IV等采用微衛(wèi)星DNA分析確定鹿鼠之間的基因關(guān)系，并研究了鼠類窩內(nèi)漢坦病毒傳播的方式?！ ?/p>
2.3 病毒與宿主動物的共演化
俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)南部的7種宿主動物中存在4種漢坦病毒(HTN、PUU、SEO、KBR)。L.Minskaya等的研究表明，從非主要宿主動物分離的病毒與標(biāo)準(zhǔn)株抗原性接近，但在基因分子特征上與從主要宿主動物分離的病毒不同。A.Vaheri等的研究表明，西伯利亞旅鼠分離的TOP病毒與東方田鼠分離的KBR病毒S片段同源性核苷酸水平為82%，氨基酸水平為96%；與歐洲棕背分離的PUU病毒S片段同源性核苷酸水平為77%，氨基酸水平為87%。系統(tǒng)發(fā)生分析顯示3種病毒具有共同的起源，與相應(yīng)宿主動物細(xì)胞色素B基因系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果相一致，表明3種病毒進(jìn)化過程中有在宿主動物之間進(jìn)行的水平傳播。其中TOP病毒M、S片段3’-NCR最長，可能在3種漢坦病毒中起源最早。J.W.Song等報(bào)告韓國姬鼠來源的不同HTN病毒株，M基因324bp片段同源性95%～99%，姬鼠細(xì)胞色素B基因424bp和線粒體DNA D-環(huán)區(qū)序列差異性0%～3.1%，表明韓國不同地區(qū)姬鼠有相同的基因背景，HTN病毒具有相同的來源，在韓國沒有發(fā)現(xiàn)HTN病毒株與其宿主動物共同發(fā)生較大變異的現(xiàn)象。Heiske A.等進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)生分析表明，歐洲西部PUU病毒與瑞典、芬蘭、俄羅斯的PUU病毒不同，同一分枝PUU病毒S片段開放讀碼框架基因差異性小于8%，不同分枝PUU病毒S片段開放讀碼框架基因差異大于14%。同一分枝PUU病毒核蛋白氨基酸序列差異0%～2%，不同分枝PUU病毒核蛋白氨基酸序列差異3%～5%。有資料表明，不同地區(qū)的歐洲棕背可以分為幾個(gè)亞類，這一研究支持了PUU病毒與其宿主動物共演化的觀點(diǎn)。L.Ivanov等對來源于俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)東方田鼠的KBR病毒進(jìn)行研究，結(jié)果表明不同KRB病毒株間存在0.5%～4.0%的基因差異，基因差異與捕鼠地區(qū)的關(guān)系大于與捕鼠年份的關(guān)系，表明KBR病毒與東方田鼠之間存在長期的共演化過程?！ ?/p>
3 疫苗與抗病毒研究
近年來HFRS疫苗的研制取得了較大的進(jìn)展，有些類型的疫苗已經(jīng)國家批準(zhǔn)生產(chǎn)使用，有的已進(jìn)入臨床觀察中，有的正在試驗(yàn)室研制和檢測中。中國已經(jīng)研制成功并試生產(chǎn)的3種單價(jià)滅活疫苗經(jīng)大面積人群接種觀察，安全性較好，并具有較好的血清學(xué)和流行病學(xué)效果。近期(基礎(chǔ)免疫后1年)和中期(基礎(chǔ)免疫后2年)平均保護(hù)率，Ⅱ型地鼠苗分別為97.81%、88.73%；Ⅰ型上海沙鼠苗分別為94.08%、91.72%；Ⅰ型天元沙鼠苗均為100.00%；Ⅰ型鼠腦苗分別為88.45%、100.00%。滅活雙價(jià)沙鼠腎疫苗進(jìn)行的Ⅱ期臨床試驗(yàn)，總反應(yīng)率為2.5%，3針后免疫熒光抗體陽轉(zhuǎn)率100.00%，中和抗體陽轉(zhuǎn)率87.6%(針對Ⅰ型病毒)和96.3%(針對Ⅱ型病毒)，單一血清型陽轉(zhuǎn)率100.00%，兩種血清型同時(shí)陽轉(zhuǎn)率75.00%。韓國生產(chǎn)的漢坦病毒滅活鼠腦疫苗(Hantavax)的研究表明，基礎(chǔ)免疫1年后免疫熒光試驗(yàn)和高密度顆粒凝集試驗(yàn)檢測血清抗體陽性率分別為42.5%和45%，中和抗體陽性率13%。基礎(chǔ)免疫1年時(shí)加強(qiáng)免疫后，血清抗體陽性率92%，中和抗體陽性率升高至80%。此外，D.Koletzki等構(gòu)建了攜帶漢坦病毒核蛋白基因的乙肝病毒嵌合體，在使用和不使用佐劑的條件下免疫動物，都產(chǎn)生針對乙肝病毒和漢坦病毒的特異抗體。K.Kamrud等對裸病毒DNA和甲病毒表達(dá)的漢坦病毒進(jìn)行了評價(jià)。采用噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)，C.de Carvalho Nicacio等、Tuomas Heiskanen等和梁米芳等分別研制了抗?jié)h坦病毒的重組抗體，為未來HFRS的免疫治療開辟了前景。W.E.Severson等報(bào)告了病毒唑對漢坦病毒復(fù)制的影響?！ ?/p>
4 分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)
各國學(xué)者在多方面進(jìn)行了漢坦病毒的分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究。T.M.Welzel等和白雪帆等采用基因片段噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)，研究了漢坦病毒單克隆抗體識別位點(diǎn)。E.Mackow等制備了針對桿狀病毒表達(dá)的SN病毒核蛋白的單克隆抗體，用于HPS相關(guān)病毒的血清學(xué)分型研究，并通過NY-1病毒核蛋白突變研究了單克隆抗體的識別位點(diǎn)。J.W.Hooper等用含有漢坦病毒反基因組的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染Vero-E6細(xì)胞后，可以用免疫沉淀的方法檢出所表達(dá)的NP和G1、G2糖蛋白，但不能用生化和功能分析檢出聚合酶蛋白，也未檢出感染性病毒。B.Anheier等的研究表明，漢坦病毒G1、G2聚合物在高爾基體的定位由G1蛋白引導(dǎo)，G2蛋白穩(wěn)定分子定位，G1蛋白氨基酸的變化可能改變G1結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響聚合物的形成。E.V.Ravkov等的研究表明，BCC病毒核蛋白與肌動朊纖維相互作用，可能在漢坦病毒的裝配和/或釋放過程中起重要作用。B.J.Meyer等采用Northern雜交、RNase保護(hù)試驗(yàn)、RT-PCR、克隆測序等方法，對漢坦病毒在Vero-E6細(xì)胞內(nèi)的持續(xù)感染進(jìn)行了研究?！ ?/p>
5 流行病學(xué)
智利1995年發(fā)現(xiàn)首例HPS病人，1995年10月至1997年7月發(fā)病僅8例，1997年～12月發(fā)病20例，涉及全國11個(gè)地區(qū)，平均發(fā)病年齡29.7歲，病死率61%。病毒基因分析表明，發(fā)病主要由Andes病毒引起。作者認(rèn)為，HPS病例的增加與當(dāng)?shù)貪h坦病毒宿主動物數(shù)量的增加有關(guān)。俄羅斯1978～1996年共發(fā)生HFRS91 639例，分布于89個(gè)行政區(qū)中的61個(gè)，其中96.4%來自俄羅斯歐洲部分，3.6%來自亞洲部分，年平均死亡率分別為4.0/10萬和0.6/10萬。血清學(xué)和基因分型表明，俄羅斯至少存在6種血清型的漢坦病毒：HTN、PUU、SEO、TUL、KRB、TOP。比利時(shí)1995年10月至1996年12月發(fā)生HFRS 199例，季節(jié)分布表現(xiàn)為冬春季的小高峰和夏秋季的大高峰，病人主要為PUU血清型感染。加拿大截止1997年11月共發(fā)生HPS 21例，分布于3個(gè)西部省份，病死率33%，流行病學(xué)調(diào)查表明全國都有攜帶病毒的宿主動物分布，而HPS發(fā)病與接觸鼠類的機(jī)會有關(guān)。日本從17個(gè)海港中的16個(gè)和3個(gè)飛機(jī)場中的2個(gè)檢出宿主動物攜帶漢坦病毒，作者提出應(yīng)建立監(jiān)測體系并采取相應(yīng)預(yù)防措施，檢查人群病毒感染率。
6 生態(tài)學(xué)
氣候、鼠類棲息地條件、鼠類繁殖強(qiáng)度、種群構(gòu)成等因素的變化影響鼠密度，而宿主動物病毒感染率隨著時(shí)間和地點(diǎn)的不同不斷發(fā)生變化。不同的鼠密度、宿主動物病毒感染率和與人群接觸的機(jī)會，影響疾病的暴發(fā)或散發(fā)。T.S.Chiueh等對臺灣進(jìn)行的血清流行病學(xué)研究表明，當(dāng)?shù)仉m然沒有確診的HFRS病人，在宿主動物中卻存在漢坦病毒的感染，在與鼠類接觸的職業(yè)人群和慢性腎衰及發(fā)熱病人中，血清抗體陽性率較高。C.Ahlm等報(bào)告瑞典北部野生駝鹿具有較低的漢坦病毒感染率。Yun-Tai Lee等發(fā)現(xiàn)，韓國蝙蝠、棕頭鴉雀攜帶PUU病毒。O.A.Alexeyev等的研究表明，在PUU抗體陽性歐洲棕背中，大部分(74%)不能檢出病毒RNA或抗原，也不具有感染性。此外，為表示漢坦病毒株對Vero-E6細(xì)胞適應(yīng)能力與宿主動物種類的關(guān)系，L.Ivanov等用鼠肺標(biāo)本漢坦病毒抗原滴度、病毒分離成功率、病毒分離天數(shù)等計(jì)算適應(yīng)指數(shù)，黑線姬鼠為0.32，大林姬鼠為0.17，東方田鼠為0.10，棕背為0.06?！ ?/p>
7 臨床
多項(xiàng)報(bào)告對HFRS和HPS的后遺癥進(jìn)行了調(diào)查，研究表明兩種疾病的恢復(fù)病人與健康人比較，分別存在腎臟或肺功能的異常。M.Howard等對患有HPS的孕婦進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果表明患有HPS的孕婦預(yù)后與其他HPS患者相同，患有HPS孕婦的胎兒與其他患有成人呼吸窘迫綜合征的孕婦的胎兒差異不大，研究中沒有發(fā)現(xiàn)SN病毒在人類垂直傳播的現(xiàn)象。
8 病理與免疫反應(yīng)
HL Van Epps等研究了針對HTN病毒感染的人T淋巴細(xì)胞的反應(yīng)，包括針對核蛋白或G1蛋白的和 T細(xì)胞系，部分針對核蛋白的 T細(xì)胞系與無名病毒核蛋白有交叉反應(yīng)，而針對核蛋白或G1蛋白的 T細(xì)胞系與無名病毒蛋白沒有交叉反應(yīng)。這種引起不同漢坦病毒病(HFRS和HPS)的毒株，人T細(xì)胞系的交叉反應(yīng)在病理研究和疫苗研制中具有重要意義。F.A.Ennis等進(jìn)行的另一項(xiàng)研究，從HPS病人血中分離和 T細(xì)胞系，有些細(xì)胞系識別的區(qū)域在不同漢坦病毒株間相對保守，但有些T細(xì)胞系不能識別漢坦病毒單一的氨基酸改變，另一些T細(xì)胞系能識別關(guān)系較遠(yuǎn)的分離株，如安第斯和普馬拉病毒的相應(yīng)區(qū)域。C.Mansilla等對安第斯病毒致死病人尸檢結(jié)果表明，Andes-HPS和SNV-HPS引起的病理改變和病毒抗原分布相似，但Andes-HPS病例發(fā)現(xiàn)有充血性心肌炎和Ⅱ型肺單核細(xì)胞活性，并有較多的肝染色。M.Bharadwaj等從Andes-HPS病人氣管中檢出病毒RNA，認(rèn)為安第斯病毒可能在人-人間傳播。還有報(bào)告研究了血組胺和緩激肽、類脂過氧化物、血管加壓素、溶酶體、紅細(xì)胞膜腺苷三磷酸酶等在HFRS病理改變中的作用。S.C.St Jeor等研究了SN病毒在鹿鼠體內(nèi)的持續(xù)感染，感染后幾周至幾個(gè)月內(nèi)，隨著抗體水平的增高，血清中病毒消失，其他組織中病毒減少。Karen L.Hutchinson等研究了BCC病毒在刺毛棉鼠體內(nèi)的感染，感染后前幾周，定量PCR在除血液外的各組織中檢出病毒cRNA，以后病毒cRNA減少，感染5個(gè)月后只在腦內(nèi)檢出；感染后1周血液中存在感染性病毒，2周時(shí)達(dá)高峰，3周時(shí)顯著減少；感染后5個(gè)月在腎上腺、肝、腎、睪丸仍可低水平檢出感染性病毒；感染后70d內(nèi)尿中可分離到病毒；感染14d后可檢出BCC抗體。楊守敬等的研究表明，HFRS的休克和出血引起的局部缺血可以導(dǎo)致熱休克反應(yīng)，在病人組織中表達(dá)72KD和73KD的熱休克蛋白，保護(hù)組織細(xì)胞免于損傷。他們的另一項(xiàng)研究，通過增生細(xì)胞核抗原以及細(xì)胞分裂中波形蛋白抗體的檢測表明，在HFRS組織損傷過程中，存在細(xì)胞的再生和DNA的修復(fù)，修復(fù)程度與損傷的嚴(yán)重程度有關(guān)。
HFRS是嚴(yán)重危害我國人民健康的病毒性疾病之一。自80年代初成功分離病毒以來，HFRS和漢坦病毒的研究取得了大量成果，尤其近年來滅活疫苗的研制成功，為有效預(yù)防本病創(chuàng)造了條件。但我們在病原學(xué)、實(shí)驗(yàn)診斷、免疫病理和分子生物學(xué)等方面與國外研究尚有差距，仍存在許多有待解決的問題。隨著今后研究的深入，對本病認(rèn)識的逐步加深，才能最終有效控制本病在我國的流行。
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