原位雜交技術(shù)
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原位雜交技術(shù)(In situ hybridization，ISH)是分子生物學(xué)、組織化學(xué)及細(xì)胞學(xué)相結(jié)合而產(chǎn)生的一門新興技術(shù)，始于20世紀(jì)60年代。1969年國(guó)耶魯大學(xué)的Gall等(1969)首先用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細(xì)胞雜交，將該基因進(jìn)行定位，與此同時(shí)Buongiorno—Nardelli和Amaldi等(1970)相繼利用同位素標(biāo)記核酸探針進(jìn)行了細(xì)胞或組織的基因定位，從而創(chuàng)造了原位雜交技術(shù)。自此以后，由于分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，特別是20世紀(jì)70年代末到80年代初，分子克隆、質(zhì)粒和噬菌體DNA的構(gòu)建成功，為原位雜交技術(shù)的發(fā)展奠定了深厚的技術(shù)基礎(chǔ)。
原位雜交的基本原理
原位雜交技術(shù)的基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸(即探針)與組織、細(xì)胞或染色體上待測(cè)DNA或RNA互補(bǔ)配對(duì)，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測(cè)手段將待測(cè)核酸在組織、細(xì)胞或染色體上的位置顯示出來(lái)。為顯示特定的核酸序列必須具備3個(gè)重要條件：組織、細(xì)胞或染色體的固定、具有能與特定片段互補(bǔ)的核苷酸序列(即探針)、有與探針結(jié)合的標(biāo)記物(曾呈奎等2000)。
幾種原位雜交技術(shù)
1 基因組原位雜交技術(shù)
基因組原位雜交(Genome in situ hybridization，GISH)技術(shù)是20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來(lái)的一種原位雜交技術(shù)。它主要是利用物種之間DNA同源性的差異，用另一物種的基因組DNA以適當(dāng)?shù)臐舛茸鞣庾瑁诎腥旧w上進(jìn)行原位雜交。GISH技術(shù)最初應(yīng)用于動(dòng)物方面的研究(Pinkel et a1．1986)，在植物上最早應(yīng)用于小麥雜種和栽培種的鑒定(余舜武等 2001；王文奎等 2000)。
2 熒光原位雜交技術(shù)
熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)是在已有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種非放射性DNA分子原位雜交技術(shù)。它利用熒光標(biāo)記的核酸片段為探針，與染色體上或DNA顯微切片上的特異fl-N：~行雜交，通過(guò)熒光檢測(cè)系統(tǒng)(熒光顯微鏡)檢測(cè)信號(hào)DNA序列在染色體或DNA顯微切片上的目的DNA序列，進(jìn)而確定其雜交位點(diǎn)。FISH技術(shù)檢測(cè)時(shí)間短，檢測(cè)靈敏度高，無(wú)污染，已廣泛應(yīng)用于染色體的鑒定、基因定位和異常染色體檢測(cè)等領(lǐng)域。
3 多彩色熒光原位雜交技術(shù)
多彩色熒光原位雜交(Multicolor fluorescence in situ hybridization，mFISH)是在熒光原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新技術(shù)，它用幾種不同顏色的熒光素單獨(dú)或混合標(biāo)記的探針進(jìn)行原位雜交，能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶位，各靶位在熒光顯微鏡下和照片上的顏色不同，呈現(xiàn)多種色彩，因而被稱為多彩色熒光原位雜交。它克服了FISH技術(shù)的局限，能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因，在檢測(cè)遺傳物質(zhì)的突變和染色體上基因定位等方面得到了廣泛的應(yīng)用(楊明杰等1998)。
4 原位PCR
原位PCR技術(shù)是常規(guī)的原位雜交技術(shù)與PCR技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，即通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)靶核酸序列在染色體上或組織細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行原位擴(kuò)增使其拷貝數(shù)增加，然后通過(guò)原位雜交技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)靶核酸序列進(jìn)行定性、定位和定量分析。原位PCR技術(shù)大大提高了原位雜交技術(shù)的靈敏度和專一性，可用于低拷貝甚至單拷貝的基因定位，為原位雜交技術(shù)的發(fā)展提供了更廣闊的發(fā)展前景。
原位雜交技術(shù)因其高度的靈敏性和準(zhǔn)確性而日益受到許多科研工作者的歡迎，并廣泛應(yīng)用到基因定位、性別鑒定和基因圖譜的構(gòu)建等研究領(lǐng)域。目前原位雜交技術(shù)在植物中的應(yīng)用比較廣泛，例如在棉花、麥類和樹(shù)木等的遺傳育種方面取得了顯著的成就，在畜牧上原位雜交技術(shù)主要用于基因定位和基因圖譜的構(gòu)建以及轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)和性別鑒定等方面。在水產(chǎn)方面，原位雜交技術(shù)則主要應(yīng)用于基因定位(多見(jiàn)于對(duì)魚(yú)類和貝類等水生物的研究)和病毒的檢測(cè)(多見(jiàn)于蝦類)。此外，原位雜交技術(shù)做為染色體高分辨顯帶技術(shù)的補(bǔ)充和發(fā)展，在水生物的細(xì)胞遺傳學(xué)的研究領(lǐng)域?qū)l(fā)揮更重要的作用。同其他的生物技術(shù)一樣，原位雜交技術(shù)在其發(fā)展與應(yīng)用的過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)一些問(wèn)題，但隨著原位雜交技術(shù)的不斷改進(jìn)與完善以及檢測(cè)手段的改進(jìn)，原位雜交技術(shù)的優(yōu)越性越來(lái)越突出，其應(yīng)用也會(huì)更加廣泛。
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