醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)/基因探針

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醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)基礎(chǔ)

基因診斷
- 基因診斷的原理
  - 基因探針
  - 限制性核酸內(nèi)切酶
  - 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性

基因探針（probe）就是一段與目的基因或DNA互補(bǔ)的特異核苷酸序列，它可以包括整個(gè)基因，也可以?xún)H僅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來(lái)的RNA。

1．探針的來(lái)源 DNA探針根據(jù)其來(lái)源有3種：一種來(lái)自基因組中有關(guān)的基因本身，稱(chēng)為基因組探針（genomic probe）；另一種是從相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄獲得了mRNA，再通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄得到的探針，稱(chēng)為cDNa 探針（cDNa probe）。與基因組探針不同的是，cDNA探針不含有內(nèi)含子序列。此外，還可在體外人工合成堿基數(shù)不多的與基因序列互補(bǔ)的DNA片段，稱(chēng)為寡核苷酸探針。

2．探針的制備 進(jìn)行分子突變需要大量的探針拷貝，后者一般是通過(guò)分子克隆（molecular cloning）獲得的?？寺∈侵赣脽o(wú)性繁殖方法獲得同一個(gè)體、細(xì)胞或分子的大量復(fù)制品。當(dāng)制備基因組DNA探針進(jìn)，應(yīng)先制備基因組文庫(kù)，即把基因組DNA打斷，或用限制性酶作不完全水解，得到許多大小不等的隨機(jī)片段，將這些片段體外重組到運(yùn)載體（噬菌體、質(zhì)粒等）中去，再將后者轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)?a href="/w/%E5%AE%BF%E4%B8%BB" title="宿主">宿主細(xì)胞如大腸肝菌，這時(shí)在固體培養(yǎng)基上可以得到許多攜帶有不同DNA片段的克隆噬菌斑，通過(guò)原位雜交，從中可篩出含有目的基因片段的克隆，然后通過(guò)細(xì)胞擴(kuò)增，制備出大量的探針。

為了制備cDNA 探針，首先需分離純化相應(yīng)mRNA，這從含有大量mRNA的組織、細(xì)胞中比較容易做到，如從造血細(xì)胞中制備α或β珠蛋白mRNA。有了mRNA作模板后，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，就可以合成與之互補(bǔ)的DNA(即cDNA)，cDNA與待測(cè)基因的編碼區(qū)有完全相同的堿基順序，但內(nèi)含子已在加工過(guò)程中切除。

寡核苷酸探針是人工合成的，與已知基因DNA互補(bǔ)的，長(zhǎng)度可從十幾到幾十個(gè)核苷酸的片段。如僅知蛋白質(zhì)的氨基酸順序量，也可以按氨基酸的密碼推導(dǎo)出核苷酸序列，并用化學(xué)方法合成。

3.探針的標(biāo)記 為了確定探針是否與相應(yīng)的基因組DNA雜交，有必要對(duì)探針加以標(biāo)記，以便在結(jié)合部位獲得可識(shí)別的信號(hào),通常采用放射性同位素32P標(biāo)記探針的某種核苷酸α磷酸基。但近年來(lái)已發(fā)展了一些用非同位素如生物素、地高辛配體等作為標(biāo)記物的方法。但都不及同位素敏感。非同位素標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是保存時(shí)間較長(zhǎng),而且避免了同位素的污染。最常用的探針標(biāo)記法是缺口平移法(nicktranslation)，其原理如圖13-1。首先用適當(dāng)濃度的DNA酶Ⅰ（DNAseⅠ）在探針DNA雙鏈上造成缺口，然后再借助于DNA聚合酶Ⅰ（DNa poly merasⅠ）的5’→3’的外切酶活性，切去帶有5’磷酸的核苷酸；同時(shí)又利用該酶的5’→3’聚酶活性，使32P標(biāo)記的互補(bǔ)核苷酸補(bǔ)入缺口，DNA聚合酶Ⅰ的這兩種活性的交替作用，使缺口不斷向3’的方向移動(dòng)，同時(shí)DNA鏈上的核苷酸不斷為32P標(biāo)記的核苷酸所取代。

缺口平移標(biāo)記法粗線示標(biāo)記部分

圖13-1 缺口平移標(biāo)記法粗線示標(biāo)記部分

探針的標(biāo)記也可以采用隨機(jī)引物法，即向變性的探針溶液加入6個(gè)核苷酸的隨機(jī)DNA小片段，作為引物，當(dāng)后者與單鏈DNA互補(bǔ)結(jié)合后，按堿基互補(bǔ)原則不斷在其3’OH端添加同位素標(biāo)記的單核苷酸，這樣也可以獲得比放射性很高的DNA探針。