內(nèi)切酶
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內(nèi)切酶（incision enzyme），即限制性核酸內(nèi)切酶。亦稱限制性核酸酶。 這是一類能從DNA分子中間水解磷酸二酯鍵,從而切斷雙鏈DNA的核酸水解酶。它們不同于一般的脫氧核糖核酸酶（DNase）,它們的切點(diǎn)大多很嚴(yán)格，要求專一的核苷酸順序
——識(shí)別順序。長(zhǎng)期以來，難以深入研究的DNA大分子,借此可以切割成特定的小片段來分析。限制性核酸酶的發(fā)現(xiàn),為基因結(jié)構(gòu)、DNA堿基順序分析和基因工程的研究開辟了途徑。為此，W.阿爾伯，H.史密斯和D.內(nèi)森斯三人共同獲得了1978年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。
一種能催化多核苷酸的鏈斷裂的酶，只對(duì)脫氧核糖核酸內(nèi)一定堿基序列中某一定位置發(fā)生作用，把這位置的鏈切開。通過內(nèi)切酶可以把某一個(gè)遺傳基因切下來，若再連在別的細(xì)胞的遺傳基因上，便可使這細(xì)胞具有新的遺傳特性。內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和采用，使基因工程成為可能?！ ?/p>
內(nèi)切酶的分類
內(nèi)切酶主要分成三大類。第一類內(nèi)切酶能識(shí)別專一的核苷酸順序，并在識(shí)別點(diǎn)附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機(jī)的。這類限制性內(nèi)切酶在DNA重組技術(shù)或基因工程中沒有多大用處，無法用于分析DNA結(jié)構(gòu)或克隆基因。這類酶如EcoB、EcoK等。
第二類內(nèi)切酶能識(shí)別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。由于這類限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和切割的核苷酸都是專一的。所以總能得到同樣核苷酸順序的DNA片段，并能構(gòu)建來自不同基因組的DNA片段，形成雜合DNA分子。因此，這種限制性內(nèi)切酶是DNA重組技術(shù)中最常用的工具酶之一。這種酶識(shí)別的專一核苷酸順序最常見的是4個(gè)或6個(gè)核苷酸，少數(shù)也有識(shí)別5個(gè)核苷酸以及7個(gè)、9個(gè)、10個(gè)和11個(gè)核苷酸的。如果識(shí)別位置在DNA分子中分布是隨機(jī)的，則識(shí)別4個(gè)核苷酸的限制性內(nèi)切酶每隔46（4096）個(gè)核苷酸就有一個(gè)切點(diǎn)。人的單倍體基因組據(jù)估計(jì)為3×199核苷酸，識(shí)別4個(gè)核苷酸的限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)將有（3×109/2.5×102）約107個(gè)切點(diǎn)，也就是可被這種酶切成107片段，識(shí)別6個(gè)核苷酸的限制性內(nèi)切酶也將有（3×109/4×103）約106個(gè)切點(diǎn)。
第二類內(nèi)切酶的識(shí)別順序是一個(gè)回文對(duì)稱順序，即有一個(gè)中心對(duì)稱軸，從這個(gè)軸朝二個(gè)向“讀”都完全相同。這種酶的切割可以有兩種方式。一是交錯(cuò)切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。如EcoRI的識(shí)別順序?yàn)椋?/p>
↓ ｜
5’……GAA ｜ TTC……3’
3’……CTT ｜ AAG……5’
｜ ↑
垂直虛線表示中心對(duì)稱軸，從兩側(cè)“讀”核苷酸順序都是GAATTC或CTTAAG，這就是回文順序（palindrome）。實(shí)線剪頭表示在雙鏈上交錯(cuò)切割的位置，切割后生成5’……G和AATTC……3’、3’……CTTAA和G……5’二個(gè)DNA片段，各有一個(gè)單鏈末端，二條單鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，可通過形成氫鍵而“粘合”。另一種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如HaeⅢ的識(shí)別位置是：
↓
5’……GG↓CC……3’
3’……CC↓GG……’
↑
在箭頭所指處切割，產(chǎn)生的兩個(gè)DNA片段是：
5’……GG CC……3’
和
3’……CC GG……5’
有時(shí)候兩種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別核苷酸順序和切割位置都相同，差別只在于當(dāng)識(shí)別順序中有甲基化的核苷酸時(shí)，一種限制性內(nèi)切酶可以切割，另一種則不能。例如HpaⅡ和MspⅠ的識(shí)別順序都是5’……GCGG……3’，如果其中有5’-甲基胞嘧啶，則只有HpaⅡ能夠切割。這些有相同切點(diǎn)的酶稱為同切酶或異源同工酶（isoschizomer）。
第三類內(nèi)切酶也有專一的識(shí)別順序，但不是對(duì)稱的回文順序。它在識(shí)別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈。但這幾個(gè)核苷酸對(duì)則是任意的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長(zhǎng)度DNA片段，具有各種單鏈末端。這對(duì)于克隆基因或克隆DNA片段沒有多大用處?！ ?/p>
內(nèi)切酶用于克隆PCR
克隆PCR產(chǎn)物的方法之一，是在PCR產(chǎn)物兩端設(shè)計(jì)一定的限制酶切位點(diǎn)，經(jīng)酶切后克隆至用相同酶切的載體中。但實(shí)驗(yàn)證明，大多數(shù)限制酶對(duì)裸露的酶切位點(diǎn)不能切斷。必須在酶切位點(diǎn)旁邊加上一個(gè)至幾個(gè)保護(hù)堿基，才能使所定的限制酶對(duì)其識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行有效切斷。
酶切位點(diǎn)（內(nèi)切酶的識(shí)別序列）要加在引物的5'端，為保證PCR產(chǎn)物能被限制性內(nèi)切酶的識(shí)別且有效的酶切，一般在引物的5'端酶切位點(diǎn)側(cè)邊加上保護(hù)堿基。
具體為：5'-保護(hù)堿基＋酶切位點(diǎn)＋引物序列-3'
詳細(xì)可參見，如下圖：
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