臨床生物化學(xué)/基因庫的建立
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建立基因庫的目的是為了便于目的基因的保存、擴(kuò)增和純化?;驇焓抢霉ぞ呙?,通過基因重組技術(shù)和轉(zhuǎn)化、篩選而建立,也是基因克隆的過程。實(shí)際上是利用低等生物如細(xì)菌、病毒、噬菌體等生長快,繁殖力強(qiáng)的特點(diǎn),而作為一種核酸擴(kuò)增篩選的載體,把人類等高等生物的基因或其片段用工具酶插入,重組于其中,經(jīng)篩選,克隆得到目的基因與載體重組的重組基因,成為便于保存,取用方便的基因庫。基因庫交流是研究室之間交流目的基因的常用方式。
(一)基因重組
基因重組方案很多,簡單的可用同一種限制性內(nèi)切酶分別在載體和目的基因切出相對應(yīng)的切口,便于連接。也可用末端連接酶合成連接器(圖18-3)。近年,Okayama方案為實(shí)驗(yàn)室普遍采用,該方法可得到全長的cDNA。
(二)轉(zhuǎn)化
轉(zhuǎn)化目的是把有復(fù)制能力,但在細(xì)胞外無復(fù)制活性的目的基因-載體重組體裝入細(xì)胞(大腸埃希菌),使目的基因隨載體在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)步驟介紹如下:
圖18-3 基因重組方案之一
⒈大腸埃希菌的處理(增加細(xì)胞膜通透性,便于基因進(jìn)入細(xì)胞)大腸埃希菌(E.Coli cells)接種于Lb agar培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)一晚。挑選3~5個大菌落,接種于50ml LB培養(yǎng)基,37℃,振搖培養(yǎng)一晚后,在A550測定,要求細(xì)菌繁殖一定量(一般為細(xì)菌對數(shù)生長期),野生型(rec+,5x107cells/ml)為0.2-0.3,缺陷型(rec-,5x107cells/ml)為0.5-0.6。離心棄去上清液,用20ml,50mmol/L,CaCl2懸浮菌體。冰浴20分鐘,低溫離心。棄上清液,用2.5ml冰50mmol/l CaCl2懸浮。4℃可保存48小時,用于轉(zhuǎn)化,稱competent cells。
⒉質(zhì)粒(如經(jīng)基因重組建立的重組質(zhì)粒,基因庫等)的轉(zhuǎn)化 將competent cells(以美國BRL公司DH10B菌株為例)置冰水浴。同時將Falcon2059(傳熱系數(shù)穩(wěn)定)塑料試管置冰水浴。取100μl菌液(DH10B)于2059試管中,加10倍稀釋的巰基乙醇1μl,冰浴輕搖2分鐘,放置10分鐘。取0.1-50ng質(zhì)粒加入試管,輕輕搖勻,冰浴30分鐘。此間備好42℃水浴。并將SOC培養(yǎng)基置42℃?zhèn)溆谩⒃嚬苤糜?2℃,輕搖45秒鐘,馬上置冰浴2分鐘。使competent cells熱脹冷縮,把質(zhì)粒導(dǎo)入菌體。加42℃SOC培養(yǎng)基0.9ml于試管,37℃培養(yǎng)1小時。1000rpm離心10分鐘,棄上清液,用200μlSOC培養(yǎng)基懸浮菌體。接種于LB-氨芐青霉素(100U/ml)培養(yǎng)皿,37℃培養(yǎng)一晚。已轉(zhuǎn)化的菌體可形成菌落(因質(zhì)粒上有抗氨芐青霉素基因)。在了解目的基因或其產(chǎn)物的基礎(chǔ)上對菌落進(jìn)行鑒定。并在LB培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)?;驇斓慕?、轉(zhuǎn)化、篩選、擴(kuò)增、純化的過程就是基因克隆的過程。
LB培養(yǎng)基(1L):10g蛋白胨,5g酵母膏,10gNaCl,高壓滅菌,pH7.5。
SOB培養(yǎng)基(1L):20g蛋白胨,5g酵母膏,0.5gNaCl,高壓滅菌。另外準(zhǔn)備2mol/L鎂溶液(1mol/L氯化鎂與1mol/L硫酸鎂等量混勻,過濾滅菌),臨用前加1ml于100ml培養(yǎng)基。
SOC培養(yǎng)基(100ml):臨用前加入1ml過濾滅菌的2mol/L葡萄糖。
目的基因 | 核酸的分離與純化 |
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